菊花葡萄酒中多酚類化合物的分析

宮英振，李敬川，張昂，裴俊青，劉俊

1.河北省林業和草原科學研究院 河北省林木良種技術創新中心（石家莊 050061）；2.秦皇島出入境檢驗檢疫局技術中心（秦皇島 066004）；3.棗強自然資源和規劃局（衡水 053100）

為了生產符合國人口味、具有中國特色的葡萄酒，研究人員展開了菊花特色系列葡萄酒的研發。曾有研究發現菊花（杭白菊）加入未對干紅葡萄酒的常規理化特性產生不利影響[1]。葡萄酒中含有大量的酚類物質，其中大部分來源于葡萄果實，對葡萄酒的感官品質有極大的影響，尤其對紅葡萄酒的色澤、苦味、收斂性、澄清度和穩定性等起重要作用。此次試驗采用超高效液相色譜-串聯質譜法（UPLC-MS/MS）對葡萄酒樣中的29種酚類化合物單體物質進行分析，以試圖研究菊花加入對干紅葡萄酒中酚類化合物的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

菊花干紅葡萄酒樣品（自釀），釀酒葡萄為赤霞珠品種，葡萄酒發酵采用常規工藝釀造[1]。在葡萄破碎后添加干菊花，直至酒精發酵結束，隨同皮渣一起分離。

酚類物質標準品（色譜純，純度≥95%：德國Sigma-Aldrich公司）：沒食子酸（gallicacid，GA）、原兒茶酸（protocatechuate acid，PA）、(+)-兒茶素[(+)-catechin，CA]、(-)-表兒茶素[(-)-epicatechin，EC]、(-)-表沒食子兒茶素[(-)-epigallocatechin，EGC]、(-)-表沒食子兒茶素沒食子酸酯[(-)-epigallocatechin gallate，EGCG]、(-)-表兒茶素沒食子酸酯[(-)-epicatechin gallate，ECG]、咖啡酸（caffeic acid，CAA）、反式阿魏酸（trans-ferulic acid，FA）、對香豆酸（trans-p-coumaricacid，p-CA）、綠原酸（chlorogenic acid，CGA）、順式白藜蘆醇（cis-resveratrol，cis-Res）、反式白藜蘆醇（trans-resveratrol，trans-Res）、順式白藜蘆醇-3-O-β-D-葡萄糖苷（resveratrol-3-O-β-D-glycoside，Res-3-Gly）、山柰酚（kaemperol，Kae）、槲皮素（quercet in，Que）、槲皮素-3-O-葡萄糖苷（quercetin-3-glucoside，Que-3-Glu）、楊梅素（myricetin，Myr）、桑色素（morin hydrate，Mor）、漆黃素（fisetin，Fis）、芹菜素（apigenin，Api）、木犀草素（luteolin，Lut）、牡荊素-2-O-鼠李糖苷（vitexin，Vit）、原花青素B1（procyandin B1，Pro B1）、原花青素B2（procyandin B2，Pro B2）、白皮杉醇（piceatannol，Pic）、香草酸（vanillic acid，VA）、葡萄素（viniferin，Vin）、紫鉚因（butein，But）。流動相：甲酸、乙腈（色譜純，美國Fisher公司）。其他試劑（分析純，上海國藥集團）。試驗用水為超純水。

Nexera LC-30A超高效液相色譜儀（日本島津公司）；QTRAP 4500三重四極桿質譜儀（配有電噴霧離子源、Turbo V離子源和Analyst 1.5數據處理系統，美國AB Sciex公司）；ACQUITY UPLC? BEH C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm，美國Waters公司）；Milli-Q去離子水機（美國Millipore公司）；3-30KS超高速離心機（美國熱電公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 葡萄酒樣品處理

葡萄酒發酵結束，取葡萄酒原酒酒樣。分析測定前經0.45 μm膜過濾，然后取1 mL經過濾酒樣，用10%甲醇溶液（含0.1%甲酸）稀釋100倍，按26 000 r/min離心5 min后取上清液進行測定，根據測定結果重新取樣1 mL稀釋至適當濃度重復離心，取上清液至進樣瓶待測。

1.2.2 單體酚標準溶液和基質液配制

單體酚標準品使用0.1%甲酸-甲醇溶液配制成100 mg/L的標準儲備液，于-20 ℃保存。使用時將儲備液使用10%甲醇（含有0.1%甲酸）溶液逐級稀釋成所需質量濃度標準工作液或混合標準工作液。

1.2.3 UPLC條件

柱溫為30 ℃，進樣體積為10 μL，流速為0.25 mL/min，C18色譜柱分離，流動相A為0.1%甲酸水，流動相B為0.1%甲酸乙腈。洗脫程序：0~3.00 min，5%B；3.00~6.00 min，30% B；6.00~9.00 min，50% B；9.00~12.00 min，70% B；12.00~17.00 min，5% B。

1.2.4 MS條件

離子源：電噴霧離子源；掃描方式：負離子模式；檢測方式：多反應監測；離子源溫度500 ℃；噴霧電壓：-4 500 V；氣簾氣壓力40 psi；碰撞氣：Medium；霧化氣壓力60 psi；輔助加熱氣壓力50 psi。

該方法線性回歸系數R2大于0.999，相對標準偏差在1.71%~2.87%之間，檢出限在0.2~3.5 μg/L之間，定量限在0.4~11.5 μg/L之間，加標回收率在95%~100%之間[2]。

2 結果與分析

釀酒葡萄在破碎、取汁工藝后，加入1%干菊花（杭白菊）進行浸漬、發酵，在發酵結束后，對菊花干紅、干白葡萄酒進行29種多酚類化合物含量測定，結果如表1所示。有10種酚類物質在干紅葡萄酒、干白葡萄酒均檢出，其中沒食子酸、兒茶素、表兒茶素三者為紅葡萄酒中含量最為主要的酚類物質，均接近于10 mg/L，余者都在1 mg/L以上。在白葡萄酒中，咖啡酸、兒茶素、表兒茶素、沒食子酸含量較為豐富。綠原酸、芹菜素、木犀草素三種物質為菊花中重要的藥效活性成分，在菊花葡萄酒中也以不同含量存在，其中綠原酸在檢出的酚類物質中居于最高含量水平，無論是在干紅葡萄酒中還是在干白葡萄酒中均近30 mg/L，芹菜素、木犀草素含量均在10 mg/L以下。

表1 菊花葡萄酒中酚類物質的含量 單位：mg/L

葡萄酒中酚類物質主要來自于葡萄果皮和種子，因原料、釀造工藝的差別，菊花白葡萄酒中酚類物質含量都遠低于紅葡萄酒，而在白葡萄酒中除咖啡酸、兒茶素、表兒茶素外，其他酚類化合物含量都在1 mg/L以下。綠原酸、芹菜素、木犀草素等化合物為菊花中主要的藥效活性成分[3-4]，其含量無論在菊花干紅葡萄酒中還是菊花干白葡萄酒中都遠高于對照，且綠原酸、芹菜素在紅葡萄酒與白葡萄酒之間差異不明顯，對照組含量均甚微。

3 結論

在菊花葡萄酒酚類物質分析中，檢測出綠原酸、芹菜素、木犀草素3種中藥杭白菊中重要的藥效活性成分，且綠原酸在所檢測到的全部酚類物質中含量最高。因此，菊花葡萄酒不僅使豐富了葡萄酒風味，還提升了葡萄酒自身的營養保健特性。