液質(zhì)聯(lián)用法測定部分原料中的阿維菌素

王亞會，李祥波

上海太太樂食品有限公司（上海 200000）

阿維菌素（avermectin）是一類具有殺蟲、殺螨、殺線蟲活性的十六元大環(huán)內(nèi)酯化合物，其藥物已成為高毒有機(jī)磷農(nóng)藥的替代品，被廣泛應(yīng)用于作物種植與動物養(yǎng)殖中，其作用計(jì)量小，但脂溶性較高，降解比較緩慢，導(dǎo)致此藥物在動物體內(nèi)殘留時(shí)間長，可能給食品安全帶來隱患，世界衛(wèi)生組織將其列為高毒化合物[1-5]。

許多國際組織和國家（地區(qū)）對阿維菌素殘留量進(jìn)行限制，歐盟規(guī)定各種蔬菜、水果及谷物中最大殘留量（MRL）為20 μg/kg，日本規(guī)定梨中的MRL為20 μg/kg[6]。我國對不同類別的食品規(guī)定的阿維菌素的MRL也不同，如精制芝麻、大蒜、洋蔥、姜、胡椒的MRL為50 μg/kg，小蔥的MRL為100 μg/kg，干辣椒的MRL為200 μg/kg[7]。受利益的驅(qū)使，仍有養(yǎng)殖戶違法超標(biāo)使用阿維菌素。對植物過量噴灑阿維菌素驅(qū)蟲一旦在組織中蓄積人類食用后也會產(chǎn)生危害[5]。針對精制芝麻、大蒜、胡椒、小蔥、干辣椒等生產(chǎn)原料，為確保供應(yīng)原料的食用安全，更為了保障消費(fèi)者的切身利益，研究阿維菌素藥物殘留含量的檢測方法具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

試驗(yàn)對農(nóng)業(yè)部1025號公告-5-2008動物性食品中阿維菌素類藥物殘留檢測中的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法進(jìn)行優(yōu)化，建立用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定部分蔬菜及香辛料中的檢測方法，為產(chǎn)品質(zhì)量安全的有效監(jiān)管提供技術(shù)支撐。

圖1 阿維菌素的化學(xué)結(jié)構(gòu)式

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑

乙腈、甲醇、丙酮、無水硫酸鈉、甲酸、乙酸銨、正己烷（均為色譜純，上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司）；阿維菌素標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥98%，上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司）；試驗(yàn)用水為超純水。

精制芝麻（河南駐馬店）、大蒜（山東冠縣）、胡椒（泰州）、小蔥（云南玉溪）、干辣椒（河北雞澤縣）。

液相三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀（1200 G1312B/G6460A）；電子天平（ML303，梅特勒）；電子天平（XS105DU，梅特勒）；渦旋混合器（VORTEX GENIUS3，德國IKA公司）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（R-210/V-700/V850，BUCHI實(shí)驗(yàn)儀器公司）；離心機(jī)（TG16-WS，長沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司）；0.22 μm濾膜、Zorbax SB C18（50 mm×2.1 mm×1.8 μm）、C8固相萃取柱（500 mg、6 mL）、C18固相萃取柱（60 mg、3 mL），PSA固相萃取柱（60 mg、3 mL）（均為上海安譜科學(xué)儀器公司）。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)品配制

1.2.1 阿維菌素準(zhǔn)儲備溶液

準(zhǔn)確稱取一定量阿維菌素準(zhǔn)物質(zhì)，用甲醇配成1.00 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)貯備溶液。于-18 ℃避光保存，保存期為1年。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液

吸取阿維菌素準(zhǔn)儲備溶液，用甲醇配成10 μg/mL。于-18 ℃避光保存，保存期3個(gè)月，使用前回溫到室溫。

1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)工作溶液

根據(jù)需要，臨用前吸取一定量的混合標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液，用甲醇-水（1︰1，V/V）稀釋配制成濃度梯度依次為5，10，25，50，100和200 μg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.3 試驗(yàn)條件

1.3.1 色譜條件

色譜柱為Zorbax SB C18柱（50 mm×2.1 mm×1.8 μm）；流動相為乙腈、水（0.1%甲酸，2 mmol/L乙酸銨）；柱溫35 ℃；進(jìn)樣量5 μL。

表1 液相色譜梯度洗脫條件

1.3.2 質(zhì)譜條件

離子源為電噴霧離子源（ESI）；掃描方式為正離子掃描；檢測方式為多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）；霧化氣（NEB）、氣簾氣（CUR）、輔助加熱氣（AUX）、碰撞氣（CAD）均為高純氮?dú)猓皇褂们皯?yīng)調(diào)節(jié)各氣體流量以使質(zhì)譜靈敏度達(dá)到檢測要求；噴霧電壓、去集簇電壓、碰撞能等電壓值應(yīng)優(yōu)化至最優(yōu)靈敏度；Q1，Q3均為單位分辨率（UNIT）；定性離子對、定量離子對、碰撞氣電壓、去簇電壓，見表2。

表2 阿維菌素質(zhì)譜參數(shù)

1.4 樣品前處理

1.4.1 樣品提取

從全部的樣品中取出約0.5 kg具有代表性樣品，充分?jǐn)囁椋靹颍殖?份，分別裝入潔凈的容器內(nèi)。密封作為試樣，標(biāo)明標(biāo)記。在抽樣和制樣的操作過程中，應(yīng)防止樣品受到污染或發(fā)生殘留物含量的變化。將試樣于-18 ℃冷凍保存。

準(zhǔn)確稱取2 g樣品，精確至0.01 g，置于50 mL離心管中，加入15 mL乙腈，振蕩提取2 min，按4 000 r/min離心5 min，將上清液轉(zhuǎn)移到另一50 mL離心管中，殘?jiān)?5 mL乙腈重復(fù)提取1次，按4 000 r/min離心5 min，合并2次提取液轉(zhuǎn)移至250 mL梨形瓶中，40 ℃水浴溫度下旋蒸至干。加3 mL乙腈︰水（1︰2，V/V）溶液，蝸旋震動1 min溶解殘?jiān)D(zhuǎn)移至15mL離心管中，加3 mL乙腈︰水（1︰2，V/V）溶液至梨型瓶中，蝸旋震動1 min溶解殘?jiān)D(zhuǎn)移至15 mL離心管中，合并2次溶解液，待凈化。

1.4.2 樣品凈化

依次用3 mL乙腈、3 mL乙腈︰水（4︰6，V/V）活化C8固相萃取小柱，將提取液過柱，棄去濾液，依次用3 mL乙腈︰水（4︰6，V/V），3 mL正己烷淋洗小柱，過完后減壓抽干，用6 mL乙腈洗脫。將洗脫液40 ℃氮?dú)獯蹈珊螅? mL乙腈+水溶液（1+1，V/V）溶解，過0.22 μm膜后供液質(zhì)儀器分析

1.5 結(jié)果結(jié)算

式中：X為樣品中待測組分殘留量，μg/kg；X1為樣品中待測組分含量，μg/L；W為樣品實(shí)際稱樣量，g；V為樣品最終定容體積，mL。

1.6 數(shù)據(jù)分析

所有數(shù)據(jù)以平均值表示，用Excel繪制各物質(zhì)含量變化圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)譜條件優(yōu)化

文獻(xiàn)中對于阿維菌素檢測離子對的報(bào)道較多，但是質(zhì)譜儀的結(jié)構(gòu)及設(shè)計(jì)不同，相關(guān)的電壓也不相同。將質(zhì)量濃度1 mg/mL的阿維菌素標(biāo)準(zhǔn)儲備液稀釋至0.1 μg/mL，采用蠕動泵直接進(jìn)樣方式，分別在正離子（ESI+）、負(fù)離子（ESI-）模式下進(jìn)行Q1母離子全掃描。結(jié)果表明，阿維菌素在ESI+模式下具有較高的響應(yīng)值。分別考察噴霧電壓、霧化溫度、氣簾氣、霧化氣、輔助氣對離子響應(yīng)強(qiáng)度的影響，同時(shí)對各分子離子進(jìn)行子離子掃描，選取合適的離子對，在MRM模式下優(yōu)化簇電壓和碰撞電壓。最終選定最優(yōu)參數(shù)見表2中質(zhì)譜條件，質(zhì)譜圖見圖2。

圖2 阿維菌素質(zhì)譜圖（0.1 μg/mL）

圖3 阿維菌素標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖（0.1 μg/mL）

2.2 提取溶劑的選擇

阿維菌素為脂溶性化合物，難易溶于水，易溶于甲醇、乙腈、乙酸乙酯、丙酮、乙醇。比較甲醇、乙腈和丙酮作為樣品提取劑的提取效果，試驗(yàn)結(jié)果顯示，用丙酮提取時(shí)因干辣椒、胡椒、小蔥含有色素，提取液的顏色深。甲醇對于含水量高的樣品，加入無水硫酸鈉后分離效果較差，綜上選擇乙腈作為提取溶劑。

2.3 凈化方法優(yōu)化

阿維菌素為弱極性物質(zhì)，測定樣品時(shí)，乙腈提取液中含有的極性色素、脂肪是主要干擾物質(zhì)，固相微萃取技術(shù)（SPE）可有效去除色素。選擇常用的C18、C8、PSA固相萃取柱進(jìn)行比較。C18固相萃取小柱基于鍵合的反相（二甲基十八碳硅烷）、不規(guī)則硅膠（硅膠基）顆粒。這種非極性、未封端的吸附劑提供與表面硅醇基相關(guān)聯(lián)的額外極性相互作用，因此C18具有良好的除脂能力。C8在吸附劑上與C18鍵合相類似，主要依靠非極性碳鍵相互作用。但由于C8烷基鏈較C18烷基鏈短，所以對非極性化合物保留弱于C18，有助于對非極性或弱極性吸附過強(qiáng)的樣品的洗脫。PSA有2個(gè)氨基（伯胺和仲胺），且2個(gè)氨基的pKa值更高（分別是10.1和10.9），對極乙腈提取液中的脂肪酸、性色素可有效去除。

結(jié)果表明，阿維菌素的回收率C18固相萃取小柱優(yōu)于PSA，C8優(yōu)于C18。

圖4 不同固相萃取小柱阿維菌素藥的回收率（n=6）

2.4 色譜條件優(yōu)化

阿維菌素為弱極性物質(zhì)，易在反向色譜柱中保留，故選則Zorbax SB C18（50 mm×2.1 mm×1.8 μm），試驗(yàn)采用常用的乙腈-水溶液作為色譜的流動相，但結(jié)果表明，阿維菌素化合物在C18色譜柱上峰形較差，拖尾嚴(yán)重，基線噪聲較大；在水相中加入0.1%（V/V）的甲酸后，阿維菌素在色譜柱上的基線噪聲明顯降低，提高了檢測靈敏度，水相中加入2 mmol/L的乙酸銨時(shí)，阿維菌素的色譜峰型得到更好的改善，推測甲酸的加入能在一定程度上提高其在C18柱上的保留行為，因此選擇水（0.1%甲酸，2 mmol/L乙酸銨）-乙腈為流動相。

2.5 方法的線性范圍、相關(guān)系數(shù)、檢出限、定量限

采用外標(biāo)法定量，以分析物的峰面積（y）和對應(yīng)的質(zhì)量濃度（x，μg/L）進(jìn)行線性回歸計(jì)算，得到線性方程和相關(guān)系數(shù)。線性范圍為5~200 μg/L，阿維菌素的相關(guān)系數(shù)r大于0.995，通過向陰性樣品中添加標(biāo)準(zhǔn)品考察方法的檢出限、定量限，信噪比≥3為檢出限，信噪比≥10為定量限；每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品的添加量為0.2，0.5和1 μg/kg 3個(gè)水平，測得阿維菌素的檢出限為0.2 μg/kg，定量限為0.5 μg/kg。檢出限、定量限、線性相關(guān)系數(shù)、線性方程、回收率見表3。

表3 阿維菌素的線性范圍、回歸方程、方法檢出限和定量限

2.6 方法的回收率與精密度

阿維菌素在各檢測樣品中規(guī)定最高殘留限量（MRL），參考GB/T 27404—2008中的相關(guān)規(guī)定，對于已制定MRL，回收率和精密度都應(yīng)在方法測定底線、MRL、選一合適點(diǎn)進(jìn)行三水平測試，即選擇精制芝麻、大蒜、胡椒在0.2，0.5和50 μg/kg加標(biāo)水平，小蔥在0.2，0.5和100 μg/kg的加標(biāo)水平，干辣椒的在0.2，0.5和200 μg/kg的加標(biāo)水平進(jìn)行加標(biāo)回收率和精密度試驗(yàn)，重復(fù)測定至少6次。每個(gè)添加水平平行測定6次，結(jié)果見表4。精制芝麻在0.2，0.5和50 μg/kg加標(biāo)水平下加標(biāo)回收率范圍分別為76.72%~96.11%，85.47%~100.02%和91.45%~110.25%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（SRSD）分別為6.93%，6.28%和6.92%。大蒜在0.2，0.5和50 μg/kg加標(biāo)水平下加標(biāo)回收率范圍分別為79.13%~91.32%，82.14%~94.15%和86.37%~106.28%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（SRSD）分別為5.96%，5.53%和8.76%。胡椒在0.2，0.5和50 μg/kg加標(biāo)水平下加標(biāo)回收率范圍分別為80.28%~92.66%，86.24%~98.45%和90.15%~109.45%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（SRSD）分別為6.16%，4.62%和9.20%。小蔥在0.2，0.5和100 μg/kg的加標(biāo)水平加標(biāo)回收率范圍分別為76.88%~99.56%，78.04%~87.49%和89.57%~107.24%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（SRSD）分別為9.22%，4.94%和7.86%。干辣椒在0.2，0.5和200 μg/kg的加標(biāo)水平加標(biāo)回收率范圍分別為87.66%~107.68%，79.48%~89.47%和86.79%~105.46%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（SRSD）分別為7.08%，5.20%和8.12%。結(jié)果均滿足GB/T 27404—2008規(guī)定的被測組分含量＜100 μg/kg，回收率在60%~120%，被測組分含量100~1 000 μg/kg，回收率在80%~110%，精密度（相對標(biāo)準(zhǔn)偏差）≤11%的要求。

表4 阿維菌素在部分陰性蔬菜、香辛料中的加標(biāo)回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=6）

3 結(jié)論

試驗(yàn)建立部分蔬菜及香辛料中阿維菌素殘留量的高效效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測方法。該方法具有操作簡單、節(jié)省時(shí)間、檢出限低于最大殘留限量規(guī)定等優(yōu)點(diǎn)，可滿足相關(guān)食品檢測部門、食品企業(yè)等對食品中阿維菌素殘留的快速檢測，為嚴(yán)格質(zhì)量管理監(jiān)控提供必要的技術(shù)支持。