微波消解-離子色譜法測定嬰幼兒配方食品中膽堿

劉金梅，丁玉珍，葛城，周榮杰，周鈞，顏復張

澳優乳業（中國）有限公司，質量管理中心（長沙 410200）

膽堿通常以游離態膽堿、乙酰膽堿、卵磷脂、鞘磷脂等形式存在于機體的不同組織和器官中，是母乳中的必需營養成分[1-2]。膽堿含量的檢測方法主要有雷氏鹽法[3]和酶比色法[4]，該類方法選擇性差、干擾因素較多。液相色譜法[5]和液相色譜-串聯質譜法[6]也有相關研究，但前者需經衍生化處理，過程復雜，不易操作，后者對儀器設備要求較高，推廣性稍差。膽堿作為一種含氮強有機堿性化合物，可在水中完全電離，故可采用離子色譜儀進行檢測分析[7]。嬰配食品膽堿含量較高，而離子色譜法是分析無機陰、陽離子的高效分離技術，特別是對于含量較高的目標化合物更適用，具備操作簡便、效率高、準確性好等優勢[8-9]。

離子色譜法測定膽堿含量的相關研究多集中于食品[10-13]，醫學方面偶見報道[14-16]。國內對樣品中結合態膽堿的處理多采用水浴加熱-酸水解的方式[3-6]，水解時間較長，干擾因素較多，僅黃麗等[17]采用在線滲析-離子色譜法技術直接測定乳粉中膽堿，方法簡單快速，但目標峰周圍雜峰較多，易受干擾。該方法采用微波消解的方式對酸性條件下的樣品進行快速水解處理，經陽離子交換色譜柱分離，電導檢測器定量，旨在建立一種高效、精準的檢測方法，并在準確定量的同時達到降本增效的目的。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

Dionex OnGuardTMⅡA固相萃取柱（美國戴安公司）；0.22 μm水相聚醚砜針式濾器（上海安譜實驗科技股份有限公司）。

酒石酸氫膽堿標準品（1 g，安譜實驗科技股份有限公司）；濃硫酸（優級純，國藥集團化學有限公司）；鹽酸（優級純，國藥集團化學有限公司）；試驗用水均為一級水；膽堿質控樣（中國檢驗檢疫科學研究院測試評價中心）；嬰幼兒配方乳粉、嬰幼兒特殊醫學用途配方食品（市售）。

1.2 儀器與設備

Dionex ICS-5000離子色譜儀（美國Thermo Fisher Scientific公司）；Heratherm OGH100烘箱（美國Thermo Fisher Scientific公司）；ETHOS UP微波消解儀（意大利Milestone公司）；UH5300紫外可見風光光度計（日本Hitachi公司）；TG16-WS臺式高速離心機（湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司）；ME204E電子天平（瑞士Mettler-Toledo公司）；Milli-Q型純水系統（德國Merck公司）。

1.3 試劑配制

膽堿氫氧化物標準儲備液（1 000 mg/L）：稱取0.209 g烘干至恒重的膽堿酒石酸氫鹽標準品于100 mL容量瓶中，以去離子水溶解并定容至刻度線。

硫酸淋洗液（18 mmol/L）：準確量取1.36 mL濃硫酸，以去離子水定容至50 mL，配制成濃度為1 mol/L的硫酸溶液；準確量取18 mL硫酸溶液（1 mol/L），用去離子水定容至1 000 mL，臨用現配。

1.4 儀器條件

IonPac CS12A分析柱（4 mm×250 mm）；IonPac CG12A保護柱（4 mm×250 mm）；檢測器為電導檢測器；抑制器為陽離子抑制器（DionexTM CERSTM 500 4 mm）；抑制器電流106 mA；淋洗液為硫酸溶液（18 mmol/L），等度淋洗；流速1 mL/min；進樣量25 μL。

1.5 試驗方法

準確稱取25 g（精確至0.000 1 g）樣品于250 mL三角瓶中，加入200 mL去離子水振蕩溶解樣品，形成復溶樣品。稱取5 g復溶樣品于微波消解管中，加入5 g HCl（3 mol/L）溶液，搖勻。將消解管放入轉子中，按表1運行微波消解程序[18]，待微波容器溫度降至50℃以下后，將水解產物轉移至10 mL帶蓋離心管中，按10 000 r/min離心5 min，取約2 mL下層清液過0.22 μm濾膜于另一潔凈的10 mL帶蓋離心管中，取0.75 g濾液轉移至潔凈的10 mL比色管或容量瓶中，用去離子水定容至刻度，待上機檢測。

表1 微波消解程序

2 結果與討論

2.1 標準曲線的制定

考慮膽堿在酸性溶液中較穩定，參考樣品處理時加入鹽酸的量，標準工作液配制時在各工作液容量瓶（10 mL）中加入0.35 mL鹽酸（3 mol/L）溶液，并與不加鹽酸的標準工作液進行比對分析，同時以膽堿質控樣驗證兩條標準曲線的正確性。膽堿測量范圍在2~20 mg/L時，2種標準工作液的峰面積（Y）和濃度（X）均呈現良好線性關系，r2均達0.999 9，如表2所示，相較于不加鹽酸的標準工作液，含鹽酸標準工作液的峰面積均有所增加，質控樣結果為138 mg/100 g，與其在不加鹽酸標曲中的計算結果164 mg/100 g相比，更接近指定值。這是因為酒石酸氫膽堿標準物質在酸性溶液中釋放的游離膽堿更完全，而以去離子水配制的標準工作液中可能還存在部分結合態的膽堿[19]，導致標準曲線響應值偏低，從而使得樣品檢測結果偏高。標準品和樣品離子色譜圖見圖1。

圖1 膽堿離子色譜圖

表2 鹽酸對峰面積的影響

2.2 凈化柱的影響

稱取7份嬰幼兒配方牛乳粉A，因樣品基質復雜，且待測液酸性較強，采用具有調整酸性樣品pH功能的Dionex OnGuard II A凈化柱對待測液進行凈化處理，并與未經凈化處理的待測液檢測結果進行比對分析。凈化后的待測液測定結果為188 mg/100 g，相對標準偏差（SRSD）為7.19%；未凈化的待測液測定結果為189 mg/100 g，SRSD為3.64%，雖然凈化前后的檢測均值相近，但未凈化的待測液測定結果更為穩定。然而使用凈化柱可對基質起到凈化作用（如圖2所示），從而對儀器起到一定保護作用。為提高檢測效率降低檢測成本，該方法采用不凈化的方式進行處理。

圖2 不同處理的待測液離子色譜圖

2.3 方法性能評價

對同一乳粉樣品進行7次平行測定，計算7份樣品檢測結果的SRSD，檢測結果如表3所示。結果表明，7份樣品檢測結果范圍為181~188 mg/100 g，SRSD為1.49%，表明該方法的精密度良好。

表3 方法精密度

以加標回收率和質控樣品驗證該方法的準確度。選擇嬰幼兒配方牛乳粉A作為樣品進行加標回收試驗，在5 g復溶樣品中以接近樣品關注濃度的0.5，1.0和1.5倍進行加標試驗，各加標濃度做3個平行。加標回收結果如表4所示，質控樣檢測結果在指定值范圍內，為138 mg/100 g，接近指定值（145 mg/100 g），說明該方法具備良好的準確度。

表4 加標回收數據

為考察檢測方法的穩定性，該方法對同一乳粉樣品進行再現性研究，試驗數據見表5。結果表明該方法再現性良好。

表5 方法再現性

2.4 方法間比較分析

采用GB 5413.20—2013《食品安全國家標準 嬰幼兒食品和乳品中膽堿的測定》酶比色法和微波消解-離子色譜法對同一樣品進行膽堿含量的測定，樣品類型及檢測結果見表6。結果顯示，該方法檢測結果與國家標準酶比色法結果接近。通過SPSS軟件進行數據分析發現，該方法與國家標準酶比色法的檢測結果不具顯著性差異（P=0.367＞0.05），可認為結果具備一致性。然而國家標準酶比色法所需酶及試劑的種類較多，在前處理過程中耗時較長，與之相比，該方法操作簡單快捷，通量較高，在保證結果準確性的同時，能夠提升檢測效率。

表6 不同基質樣品檢測結果

3 結論

微波消解-離子色譜法可快速測定嬰幼兒配方乳粉、特殊醫學用途配方食品及輔料中膽堿含量，相較于現行國家標準中的酶比色法，采用微波消解輔助酸水解技術，可將樣品中結合態的膽堿快速分解成游離態的膽堿，且水解液經離心、過濾及稀釋處理后，可直接上機測試。該方法具備準確性高、穩定性高、再現性好等特點，同時與現行國家標準酶比色法相比，所需試劑耗材少，操作簡單、快捷，樣品通量較高，能對膽堿檢測方法的升級起到一定參考意義。