離子色譜法測定牛奶及奶制品中硝酸鹽和亞硝酸鹽

鄒沫君

樂山市食品藥品檢驗(yàn)檢測中心（樂山 614000）

硝酸鹽和亞硝酸鹽在食品加工工業(yè)中常被用作發(fā)色劑、增香劑和防腐劑[1]。如果保存和處理不當(dāng)，在硝基還原酶的作用下，食品中的硝酸鹽可能轉(zhuǎn)化為亞硝酸鹽[2-3]。過量攝入亞硝酸鹽可導(dǎo)致食用者中毒，亞硝酸鹽被人體血液吸收后，可將血紅素中Fe2+氧化為Fe3+，造成正常的血紅蛋白被氧化為高鐵血紅蛋白，從而失去攜帶氧氣的功能，出現(xiàn)組織缺氧現(xiàn)象。與此同時，亞硝酸鹽與蛋白質(zhì)代謝的中間產(chǎn)物仲胺反應(yīng)，生成強(qiáng)致癌作用的亞硝胺，對人的身體健康構(gòu)成巨大危害[4-5]。因此，食品中硝酸鹽和亞硝酸鹽的含量都必須得到有效監(jiān)控，以保障人類生活安全[6]。

在奶牛的飼養(yǎng)過程中，如果環(huán)境水源、喂養(yǎng)飼料的添加劑以及奶牛生長環(huán)境等硝酸鹽、亞硝酸鹽含量過高，都會發(fā)生牛奶中的硝酸鹽及亞硝酸鹽的超標(biāo)[7-8]。隨著人們生活質(zhì)量的提高，牛奶及奶制品在人們?nèi)粘ｏ嬍持兴急戎卦絹碓酱螅|(zhì)量安全也越來越受到重視[9]。根據(jù)GB 2762—2022[10]《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中污染物限量》規(guī)定，生乳中亞硝酸鹽（以NaNO2計(jì)）限量為0.4 mg/kg，乳粉、調(diào)制乳粉及嬰幼兒配方食品中亞硝酸鹽（以NaNO2計(jì)）限量為2.0 mg/kg，嬰幼兒配方食品中硝酸鹽（以NaNO3計(jì)）限量為100 mg/kg。因此，加強(qiáng)預(yù)防和檢測牛奶及奶制品的硝酸鹽、亞硝酸鹽污染是非常必要的。

硝酸鹽和亞硝酸鹽檢測常用的方法有分光光度法[11-12]、電化學(xué)法[13-14]、分子熒光法[15-16]、氣相色譜法[17-18]、離子色譜法[19-20]等。分光光度法操作繁瑣，需鹽酸萘乙二胺柱前衍生，操作繁瑣，干擾大，會引入重金屬污染物鎘，對檢驗(yàn)員及環(huán)境危害很大。電化學(xué)法重現(xiàn)性不好，定量結(jié)果不精確。分子熒光法易受試樣中干擾物的影響導(dǎo)致相對標(biāo)準(zhǔn)誤差增大。氣相色譜法需配備電子捕獲檢測器，衍生試劑昂貴，操作過程復(fù)雜，費(fèi)時費(fèi)力。離子色譜法一直是牛奶及奶制品中硝酸鹽及亞硝酸鹽檢測的研究熱點(diǎn)，其前處理相對簡單，分析快速，無有害物質(zhì)生成，分離度高，重現(xiàn)性好，可同時進(jìn)行多組分測試。此試驗(yàn)探索建立離子色譜法同時測定牛奶及奶制品中硝酸鹽、亞硝酸鹽的快速檢測方法，試樣用乙腈沉淀蛋白，經(jīng)固相萃取柱凈化，用陰離子交換柱IonPac AS 19分離，電導(dǎo)檢測器檢測，測定牛奶及奶制品中硝酸鹽、亞硝酸鹽的含量。旨在為更精確更快速地檢測牛奶及奶制品中硝酸鹽、亞硝酸鹽提供參考依據(jù)，達(dá)到有效監(jiān)控牛奶及奶制品中硝酸鹽、亞硝酸鹽含量的目的。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

試驗(yàn)所用牛奶和奶制品（16個批次，每個批次均來自不同的生產(chǎn)廠家，市售）；硝酸根NO3-標(biāo)準(zhǔn)品[1 000 μg/mL，唯一標(biāo)識204036-3，國家有色金屬及電子材料分析測試中心、國標(biāo)（北京）檢驗(yàn)認(rèn)證有限公司]；亞硝酸根NO2-標(biāo)準(zhǔn)品[1 000 μg/mL，唯一標(biāo)識223028-1，國家有色金屬及電子材料分析測試中心、國標(biāo)（北京）檢驗(yàn)認(rèn)證有限公司]；乙腈、冰乙酸（色譜純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司）；鹽酸（原子熒光純，成都市科隆化工試劑廠）；實(shí)驗(yàn)室用水（超純水）（電阻率為18.25 MΩ·cm）。

1.2 儀器與設(shè)備

Thermo Scientific TM ICS-1 100離子色譜系統(tǒng)（含電導(dǎo)檢測器、陰離子抑制器、自動淋洗液發(fā)生器、自動進(jìn)樣器、色譜數(shù)據(jù)系統(tǒng)，美國Thermo SCIENTIFIC公司）；XSE 205 DU電子天平[梅特勒-托利多國際貿(mào)易（上海）有限公司]；TGL-16臺式高速冷凍離心機(jī)（四川蜀科儀器有限公司）；Dionex OnGuard II RP柱（1.0 mL）、DionexOnGuard II Ag柱（1.0 mL）、DionexOnGuard II Na柱（1.0 mL），Thermo SCIENTIFIC公司；UPT-II-10 T優(yōu)普系列超純水器（四川優(yōu)普超純科技有限公司）；0.22 μm水系進(jìn)口聚醚砜PES針式過濾器（美國PALL公司）；φ15 cm定量濾紙（杭州特種紙業(yè)有限公司）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 色譜條件

色譜柱：IonPacTMAS-194 mm×250 mm（帶IonPacTMAG-19型保護(hù)柱4 mm×50 mm）；淋洗液：淋洗液自動發(fā)生器，濃度為6~70 mmol；抑制器：連續(xù)自動再生膜陰離子抑制器；檢測器：電導(dǎo)檢測器，檢測池溫度：35 ℃；淋洗液流速：1.0 mL/min；進(jìn)樣體積：50 μL。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

準(zhǔn)確移取一定量的硝酸根NO3-標(biāo)準(zhǔn)品和亞硝酸根NO2-標(biāo)準(zhǔn)品，用水逐級稀釋成硝酸根NO3-濃度分別為0.00，0.20，0.40，0.60，0.80，1.00，1.50和2.00 mg/L，亞硝酸根NO2-濃度分別為0.00，0.02，0.04，0.06，0.08，0.10，0.15和0.20 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液。在1.3.1小節(jié)色譜條件下從低到高濃度依次進(jìn)樣，得到上述各濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜圖。以硝酸根NO3-和亞硝酸根NO2-的濃度（mg/L）為橫坐標(biāo)，以峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并計(jì)算線性回歸方程。

1.3.3 試樣制備

1.3.3.1 提取

牛奶：準(zhǔn)確稱取2.5 g（精確至0.01 g）試樣于25 mL比色皿中，加5~10 mL純水，加入10 mL乙腈，加水稀釋至刻度，搖勻超聲30 min，置75 ℃水浴放置5 min。采用定量濾紙初步過濾，取濾液于10 000 r/min速度離心15 min，取上清液備用。

奶粉、奶制品：準(zhǔn)確稱取2.5 g（精確至0.01 g）試樣，置于50 mL容量瓶中，加10 mL水，待充分溶解后，加入20 mL乙腈，加水稀釋至刻度，搖勻，超聲30 min，置75 ℃水浴中放置5 min，用水稀釋至刻度。溶液經(jīng)定量濾紙過濾后，于10 000 r/min離心15 min，取上清液備用。

1.3.3.2 凈化

取15 mL濾液，依次通過0.22 μm水性濾膜針頭濾器、DionexOnGuard II Ag柱、DionexOnGuard II Na柱、DionexOnGuard II RP柱，棄去前面3 mL，收集后面洗脫液待測。固相萃取柱使用前需進(jìn)行活化：Dionex-OnGuard II Ag柱和DionexOnGuard II Na柱用10 mL水通過，靜置活化30 min，OnGuard II RP柱使用前依次用10 mL甲醇、10 mL水通過，靜置活化30 min。

空白試驗(yàn)：除不加試樣外，按1.3.3小節(jié)方法操作，即得。

1.3.4 結(jié)果計(jì)算

式中：X為試樣中硝酸根NO3-或亞硝酸根NO2-的含量，mg/kg；C為測定用試樣溶液中的硝酸根NO3-或亞硝酸根NO2-的濃度，mg/L；Co為試劑空白液中硝酸根NO3-或亞硝酸根NO2-的濃度，mg/L；V為試樣溶液體積，mL；f為試樣溶液稀釋倍數(shù)；m為試樣取樣量，g；1 000為換算系數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取條件的選擇

2.1.1 沉淀劑的選擇

牛奶及奶制品中含有豐富的蛋白質(zhì)、脂肪、碳水化合物、維生素和礦物質(zhì)等營養(yǎng)成分，為了能夠充分提取試樣中的硝酸鹽和亞硝酸鹽，此試驗(yàn)比較了不同濃度的沉淀劑乙腈、冰乙酸、鹽酸沉淀蛋白的效果，結(jié)果見圖1。由圖1可知：在乙腈與水體積比4∶6時，是理想的牛奶及奶制品中蛋白沉淀劑。

圖1 乙腈與水的體積比（A）、冰乙酸濃度（B）及鹽酸濃度（C）對硝酸鹽和亞硝酸鹽的回收率的影響

2.1.2 提取溫度的選擇

此試驗(yàn)考察了提取溫度為25，35，45，55，65，75，85和95 ℃時硝酸鹽和亞硝酸鹽的提取效果，結(jié)果見圖2。由圖2可知：不同提取溫度對硝酸鹽和亞硝酸鹽的提取率影響比較明顯，當(dāng)提取溫度在75 ℃時，硝酸鹽和亞硝酸鹽的提取率趨于穩(wěn)定，提取完全，故本試驗(yàn)選擇提取溫度為75 ℃。

圖2 提取溫度對硝酸鹽和亞硝酸鹽的回收率的影響

2.1.3 提取時間的選擇

試驗(yàn)比較了超聲時間為5，10，20，30，40，50和60 min時硝酸鹽和亞硝酸鹽的提取效果，結(jié)果見圖3。由圖3可知，隨著超聲時間的增加，硝酸鹽和亞硝酸鹽的提取率逐漸增大，到30 min后基本趨于穩(wěn)定，為了加快前處理速度，節(jié)約時間，故此試驗(yàn)選擇超聲30 min為最佳提取時間。

圖3 提取時間對硝酸鹽和亞硝酸鹽的回收率的影響

2.2 方法學(xué)驗(yàn)證

2.2.1 專屬性考察

分別取混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，陰性試樣溶液及陰性加標(biāo)試樣溶液在1.3.1小節(jié)色譜條件下進(jìn)樣50 μL，記錄色譜圖，考察試驗(yàn)方法的專屬性，結(jié)果如圖4所示。結(jié)果表明，硝酸根NO3-和亞硝酸根NO2-保留時間分別為10.39和7.56 min，峰型對稱，加標(biāo)試樣出峰良好，該方法專屬性好，選擇性高，適合牛奶及奶制品中硝酸根NO3-和亞硝酸根NO2-的測定。

圖4 混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液（A），陰性試樣溶液（B）及陰性加標(biāo)試樣溶液（C）色譜圖

2.2.2 線性關(guān)系，方法檢出限和定量限考察

取硝酸根NO3-和亞硝酸根NO2-混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，按1.3.1小節(jié)色譜條件從低到高濃度依次進(jìn)樣，分別以硝酸根NO3-和亞硝酸根NO2-的峰面積對質(zhì)量濃度計(jì)算線性回歸方程，確定相關(guān)系數(shù)。比較硝酸根NO3-和亞硝酸根NO2-色譜信號峰與基線信號，確定儀器最低檢出限（rSN=3），按試樣制備過程，分別得出方法檢出限與定量限，結(jié)果見表1。由表1可知：硝酸根NO3-在0.0~2.0 mg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（r=0.999 9），且該方法檢出限為0.075 mg/kg，定量限為0.25 mg/kg；亞硝酸根NO2-在0.0~0.20 mg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（r=0.999 9），且該方法檢出限為0.05 mg/kg，定量限為0.17 mg/kg。試驗(yàn)結(jié)果均能完全滿足分析檢測要求。

表1 回歸方程，相關(guān)系數(shù)，最低檢出限，定量限

2.2.3 方法精密度考察

取0.20 mg/L硝酸根NO3-和亞硝酸根NO2-標(biāo)準(zhǔn)溶液，在上述條件下分別重復(fù)進(jìn)樣6次，計(jì)算其結(jié)果相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（SRSD），結(jié)果見表2。由表2可知，硝酸根NO3-和亞硝酸根NO2-的峰面積SRSD分別為0.46%和0.43%，說明該方法精密度良好。

表2 方法精密度試驗(yàn)結(jié)果（n=6）

2.2.4 穩(wěn)定性考察

取制備好的牛奶試樣供試品溶液，按1.3.1小節(jié)色譜條件每間隔4 h進(jìn)樣1次，測定硝酸根NO3-和亞硝酸根NO2-的質(zhì)量濃度，結(jié)果見表3。由表3可知，硝酸根NO3-和亞硝酸根NO2-穩(wěn)定性試驗(yàn)SRSD值分別為0.64%和0.62%，說明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

表3 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果（n=7）

2.2.5 回收率考察

為考察方法的準(zhǔn)確性，分別向牛奶，奶制品試樣中添加0.25，0.5和2.5 mg/kg硝酸根NO3-標(biāo)準(zhǔn)溶液以及0.12，0.24和1.20 mg/kg亞硝酸根NO2-標(biāo)準(zhǔn)溶液，各梯度同時平行測定3次，扣除樣品空白后，硝酸根NO3-和亞硝酸根NO2-平均回收率及其SRSD如表4所示。硝酸根NO3-平均回收率在92.98%~104.53%范圍內(nèi)，SRSD為0.91%~1.23%；亞硝酸根NO2-平均回收率在92.85%~105.50%范圍內(nèi)，SRSD為0.86%~1.21%。結(jié)果表明，該檢測方法準(zhǔn)確性良好，符合分析檢測要求。

表4 加標(biāo)回收率試驗(yàn)結(jié)果（n=3）

2.2.6 實(shí)際試樣分析

利用此試驗(yàn)所建立的方法，對市面上采購的16個批次牛奶和奶制品中硝酸根NO3-和亞硝酸根NO2-進(jìn)行了測定，結(jié)果見表5。由表5可知，該方法具有良好的適用性，色譜無干擾，不同廠家牛奶和奶制品中硝酸根NO3-和亞硝酸根NO2-含量存在一定的差異，均未超過食品中污染物限量值。

表5 實(shí)際試樣檢測結(jié)果

3 結(jié)論

試驗(yàn)建立了離子色譜法測定牛奶及奶制品中硝酸鹽和亞硝酸鹽含量的方法。試樣以乙腈沉淀蛋白，超聲振蕩提取，固相萃取柱凈化除雜，采用IonPac AS 19陰離子交換色譜柱（250 mm×4 mm）分離，6~70 mmol/L KOH溶液梯度淋洗，抑制性電導(dǎo)檢測。該方法操作便捷，檢測時間短，靈敏度高，回收理想，精密度高，線性范圍廣，適合牛奶及奶制品中硝酸鹽和亞硝酸鹽的測定，可為牛奶及奶制品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的提升和食品安全監(jiān)管提供一定的數(shù)據(jù)支撐，具有良好的推廣應(yīng)用價(jià)值。