基于近紅外光譜技術快速分析大米肽的主要成分

黃瑩，趙彤，黃晶，孫鑫，陳曦，楊曉

中國健康促進基金會抗衰老營養與健康研發中心（武漢 430100）

近紅外光譜（near infrared spectroscopy，NIRS）技術是一項實現樣品定性或定量分析的綠色、快速直接分析方法[1]，其標準方法多達20余項[2]，被廣泛應用到食品、制藥等領域。研究報道，Caporaso等[3]利用NIRS技術實現谷物無損質量評估；Levasseur[4]和Femenias等[5]使用NIRS技術為谷物污染真菌后的檢測提供了便捷方法。NIRS技術在大米中的應用非常普遍，如：鑒別摻假[6]、糊化[7]；區分不同地區[8-9]、年份的大米[10]；檢測蛋白質[11]、重金屬[12]、直鏈淀粉[13]、水分[14]、脂肪酸[15]等，實現大米各項指標的快速檢測。

大米加工過程中會產生大量碎米和米糠，這些副產物通常僅簡單處理后作為動物飼料利用，近年來這些副產物被加工提取得到大米肽，因為大米肽中的氨基酸和大米蛋白基本保持一致，但大米肽具有低抗原

性，低分子量，能被腸道快速吸收而被廣泛應用。大米肽具有降血壓[16-17]、調節免疫[18-19]、抗氧化[20]、抗高尿酸[21]、預防阿爾茲海默病[22]及預防牙周炎[23]等生物活性。雖然NIRS技術在大米中的應用較為廣泛，但關于該技術在大米肽的應用鮮有報道，也缺乏相應的國家和行業標準，導致大米肽品質參差不齊，實驗利用NIRS技術建立模型，通過近紅外光譜技術快速檢測大米肽蛋白質、多肽、水分、灰分和脂肪含量的方法，為大米肽相關品質指標的快速檢測提供方法。

1 材料與方法

1.1 原料

105種大米肽（均為市售）。

1.2 材料與試劑

NaOH、CuSO4、K2SO4、H2SO4、HCl、硼酸、硫酸標準滴定溶液（國藥集團化學試劑有限公司）；TCA、酒石酸鉀鈉、乙酸鎂、無水乙醚、石油醚（沸程30~60 ℃，麥克林生化科技股份有限公司）；牛血清蛋白標準品（Albumin Bovine V cas 9048-46-8≥98%，HPLC）。

1.3 儀器與設備

SPX622ZH電子天平[奧豪斯儀器（常州）有限公司]；TDZ5-WS離心機（湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司）；TU180紫外分光光度計（北京普析通用儀器有限責任公司）；K1100全自動凱式定氮儀（海能未來技術集團股份有限公司）；JRX-10S曲線升溫消化爐（濟南精銳分析儀器有限公司）；S-433Dup全自動氨基酸分析儀[賽卡姆（北京）科學儀器有限公司]；HPX-9052MBE電熱恒溫干燥箱（上海博訊實業有限公司）；SupNIR-2700近紅外光譜儀[聚光科技（杭州）股份有限公司]。

1.4 試驗方法

1.4.1 測定蛋白質的方法

參照GB 5009.5—2016《食品安全國家標準 食品中蛋白質的測定（第一法 凱氏定氮法）》，試驗重復3次取平均值。

1.4.2 測定多肽的方法

采用雙縮脲法，參考汪志華等[24]和魯偉等[25]的方法。

標準曲線：準確配制分別為0，2，4，6，8和10 mg/mL的牛血清蛋白質標準溶液，分別取1 mL，加入4 mL雙縮脲試劑。混合均勻，在25 ℃下放置30 min，并在540 nm下測量顏色。第一支不含牛血清蛋白質溶液的比色管作為空白對照溶液。取2組測量值的平均值，以牛血清蛋白質的含量為橫坐標，吸光度為縱坐標繪制標準曲線，標準曲線方程為Y=0.047 1X+0.003 4，R2=0.999。

將市售大米肽分別準備3份，每份0.5 g左右，各用水溶解后定容至10 mL，每個樣品取1 mL分別加入3 mL 15%的三氯乙酸水溶液，于渦漩混合儀混合均勻，靜置10 min，在4 000 r/min下離心20 min，取1 mL上清液置另一支比色管中，加入4.0 mL雙縮脲試劑，搖勻后在30 ℃下放置30 min，于540 nm測定吸光度（A），試驗重復3次取平均值，肽含量（%）按式（1）計算。

式中：C為標曲查得的牛血清蛋白質質量濃度，mg/mL；V為取樣體積，mL；n為樣品稀釋倍數；m為樣品質量，g。

1.4.3 測定水分的方法

參照GB 5009.3—2016《食品安全國家標準 食品中水分的測定》（第一法 直接干燥法），試驗重復3次取平均值。

1.4.4 測定灰分的方法

參照GB 5009.4—2016《食品安全國家標準 食品中灰分的測定》（第一法 食品中總灰分的測定），試驗重復3次取平均值。

1.4.5 測定脂肪的方法

參照GB 5009.6—2016《食品安全國家標準 食品中脂肪的測定》（第一法 索氏抽提法），試驗重復3次取平均值。

1.4.6 近紅外光譜掃描參數

表1 近紅外光譜建掃描參數

1.4.7 建模方法和異常樣品剔除

根據105個大米肽樣品的蛋白質、多肽、水分、灰分和脂肪含量和近紅外的光譜數據，采用偏最小二乘（partial least squares，PLS）回歸方法分別對這5個指標建立定量模型，并對模型進行優化，結合Savitzky-Golay-平滑、Savitzky-Golay-導數、多元散射校正、均值中心化等光譜預處理方法，得到大米肽主要成分的模型，并以模型評價參數SEC、RC、SECV、SEP、RP、RPDC、RPDV表征模型的預測效果[26-27]。

建模過程中，發現異常樣品，一般要遵循重構光譜殘差、預測濃度殘差、杠桿值與學生化殘差及光譜PLS分解主成分得分的聚類分析等標準進行異常樣品的剔除[28]。

2 結果與討論

2.1 大米肽樣品掃描結果

大米肽樣品經掃描后得到的近紅外光譜如圖1所示。大米肽樣品的蛋白質、多肽、水分、灰分和脂肪含量結果見表2。

圖1 大米肽樣品近紅外反射光譜

表2 大米肽樣品的主要成分指標的含量

2.2 數據處理

對表2中105個大米肽樣品的蛋白質、多肽、水分、灰分和脂肪進行統計分析，可知：105個大米肽樣品的蛋白質含量范圍為29.73%~103.00%，平均為64.84%±21.93%；多肽含量范圍為25.88%~78.97%，平均為52.50%±16.95%；水分范圍為3.71%~8.34%，平均為6.29%±1.00%；灰分范圍為0.28%~5.63%，平均為2.07%±1.21%；脂肪的含量范圍為0.01%~0.45%，平均為0.13%±0.08%。上述指標的數據范圍可用于近紅外光譜技術定量建模，將105個數據中84個樣品作為定標集建立模型，21個樣本作為驗證集驗證模型，數據統計如表3所示。

表3 大米肽樣本主要成分數據統計

2.3 大米肽樣品主要成分模型指標的建立

利用近紅外光譜儀對大米肽樣品進行建模方法的預處理，得到各主要成分模型的最佳條件，結果如表4所示。

表4 大米肽蛋白質、多肽、水分、灰分和脂肪模型的最佳條件

通過化學計量學軟件得到各主要成分的馬氏距離值與學生化殘差值，從而排除異常樣品。發現排除異常樣品后的模型預測能力優于排除異常樣品前。最終優化后各主要成分的模型參數如表5所示。

表5 大米肽樣品蛋白質、多肽、水分、灰分和脂肪的內部驗證結果

發現模型預測值和實測值的相關系數分別為0.983 26，0.985 73，0.968 86，0.978 60和0.976 51，說明各主要成分預測值和實測值的相關性較高。將各主要成分的實測值與光譜數據相對應，擬合出大米肽蛋白質模型、多肽模型、水分模型、灰分模型和脂肪模型，如圖2所示。其中，大米肽蛋白質模型的線性方程為Y=0.983 26X+1.067 80，多肽模型的線性方程為Y=0.985 73X+0.760 69，水分模型的線性方程為Y=0.968 86X+0.195 71，灰分模型的線性方程為Y=0.978 60X+0.041 71，脂肪模型的線性方程為Y=0.976 51X+0.002 43。

圖2 基于近紅外光譜參數的大米肽蛋白質（a）、多肽（b）、水分（c）、灰分（d）和脂肪（e）的預測模型

2.4 大米肽樣品主要成分模型指標的檢驗

分別對驗證集中21個樣品進行光譜掃描，采用2.3建立的模型預測蛋白質、多肽、水分、灰分和脂肪的含量，預測值和實際值對比結果如表6所示。通過t檢驗發現，蛋白質、多肽、水分、灰分和脂肪的實測值和預測值相比較均無顯著性差異，主要表現為蛋白質（t=0.488，P=0.631＞0.05）、多肽（t=-0.180，P=0.986＞0.05）、水分（t=1.056，P=0.304＞0.05）、灰分（t=1.743，P=0.097＞0.05）和脂肪（t=1.606，P=0.124＞0.05），說明模型具有較好的預測能力。

表6 預測模型對大米肽樣品蛋白質、多肽、水分、灰分和脂肪含量的預測結果

3 結論

大米肽樣品蛋白質含量范圍為29.73%~103.00%，平均為64.84%±21.93%；多肽含量范圍為25.88%~78.97%，平均為52.50%±16.95%；水分范圍為3.71%~8.34%，平均為6.29%±1.00%；灰分范圍為0.28%~5.63%，平均為2.07%±1.21%；脂肪含量范圍為0.01%~0.45%，平均為0.13%±0.08%；數據范圍可用于近紅外光譜技術定量建模。

根據PLS分別建立大米肽蛋白質、多肽、水分、灰分和脂肪的最優模型，結果發現模型預測值和實測值的相關系數分別為0.983 26，0.985 73，0.968 86，0.978 60和0.976 51，說明各主要成分預測值和實測值的相關性較高。對模型進行外部驗證，蛋白質、多肽、水分、灰分和脂肪的實測值和預測值相比較均無顯著性差異，主要表現為蛋白質（t=0.488，P=0.631＞0.05）、多肽（t=-0.180，P=0.986＞0.05）、水分（t=1.056，P=0.304＞0.05）、灰分（t=1.743，P=0.097＞0.05）和脂肪（t=1.606，P=0.124＞0.05），說明模型具有較好的預測能力。

關于NIRs技術在大米肽的應用報道相對較少，大部分集中在大米上面的應用，如：黃林森等[29]采用近紅外定量模型快速檢測大米的營養成分，實現營養成分的快速檢測；路輝等[30]對大米直鏈淀粉、蛋白質、脂肪、水分建立近紅外光譜檢測模型，結果發現利用近紅外光譜可以實現對大米中營養成分含量同時快速無損的檢測；李路等[31]對大米蛋白質、脂肪、總糖、水分近紅外檢測模型研究，驗證該模型適用于大米營養成分的近紅外快速檢測。試驗說明NIRs技術在對大米營養成分的快速檢測十分方便和快捷，驗證NIRs技術對大米肽主要成分的快速檢測同樣適用，為大米肽主要成分的快速檢測提供理論依據。