基于不同基質(zhì)純化重組蛋白的研究進(jìn)展

張飛飛，朱睿，姜學(xué)權(quán)，胡俊毅，方逸超，汪浩勇

湖北工業(yè)大學(xué)生物工程與食品學(xué)院（武漢 430068）

近年來(lái)，重組蛋白用于晶體學(xué)研究、免疫學(xué)特性探究、酶學(xué)和醫(yī)學(xué)應(yīng)用（如藥物蛋白）及蛋白質(zhì)特性（如功能、活性和結(jié)構(gòu)）的一般性研究[1]。重組蛋白的生產(chǎn)和純化密切相關(guān)，蛋白質(zhì)生產(chǎn)宿主的選擇不僅影響蛋白質(zhì)的擴(kuò)增和分離，而且影響純化產(chǎn)物的方式，基因工程技術(shù)的不斷進(jìn)步增加宿主細(xì)胞，如細(xì)菌、哺乳動(dòng)物、昆蟲和酵母等中生產(chǎn)的大量重組蛋白的可用性，其中大腸桿菌仍是最廣泛使用的菌株[2-3]。然而，在重組蛋白質(zhì)純化過(guò)程中依然要克服許多技術(shù)難題才能獲得高質(zhì)量的蛋白質(zhì)樣品，滿足既定的純度和構(gòu)象要求，這對(duì)重組蛋白的純化和表征可能要求高、昂貴且耗時(shí)，但可以確定蛋白質(zhì)的質(zhì)量，因此，重組蛋白的成功應(yīng)用很大程度取決于其高效的下游加工，包括蛋白質(zhì)純化、質(zhì)量驗(yàn)證、量化和儲(chǔ)存等條件[4]。

蛋白質(zhì)工程功能材料的應(yīng)用前景十分廣闊，在固體材料和生物元素之間建立特定的非共價(jià)/共價(jià)相互作用的顯著能力，促進(jìn)定制和先進(jìn)功能材料的開發(fā)，以及下一代雜交材料的應(yīng)用。在蛋白純化過(guò)程中標(biāo)簽介導(dǎo)的重組蛋白可與多種材料結(jié)合，最適合用于蛋白質(zhì)純化過(guò)程，因此獲取高質(zhì)量的蛋白質(zhì)樣品被運(yùn)用于各個(gè)領(lǐng)域。主要綜述有關(guān)蛋白質(zhì)純化過(guò)程中基于不同基質(zhì)材料對(duì)目的蛋白的純化最新研究進(jìn)展。

1 重組蛋白標(biāo)簽的概述

目前，有許多蛋白質(zhì)表達(dá)的系統(tǒng)，例如大腸桿菌、畢赤酵母等可以為各種肽和蛋白質(zhì)提供對(duì)應(yīng)的表達(dá)宿主，最終將目的肽或蛋白純化出來(lái)進(jìn)行研究。因此，從其他細(xì)胞內(nèi)容物中快速且經(jīng)濟(jì)地純化活性生物重組蛋白被認(rèn)為是生物技術(shù)領(lǐng)域的最大挑戰(zhàn)之一，通過(guò)將遺傳序列與親和標(biāo)簽整合，可以促進(jìn)目標(biāo)蛋白或酶的純化。在這種情況下，目標(biāo)蛋白質(zhì)的標(biāo)簽和蛋白質(zhì)作為單個(gè)單元表達(dá)，并且可以通過(guò)標(biāo)簽純化方法從其他細(xì)胞內(nèi)容物中分離蛋白質(zhì)。親和標(biāo)簽通常被廣泛用于試驗(yàn)研究，因?yàn)樗鼈儜?yīng)用廣泛，親和標(biāo)簽的重要限制之一是標(biāo)簽對(duì)蛋白質(zhì)的自然功能、其物理化學(xué)性質(zhì)及后續(xù)應(yīng)用的意外影響，所以目標(biāo)蛋白純化后的標(biāo)簽分離必不可少，雖然該過(guò)程是通過(guò)特定的內(nèi)肽酶完成，但隨之而來(lái)的成本阻礙該技術(shù)的大規(guī)模應(yīng)用。此外，應(yīng)用的內(nèi)肽酶應(yīng)在分離過(guò)程中與蛋白質(zhì)分離，進(jìn)一步增加勞動(dòng)力成本并阻止這些標(biāo)簽在工業(yè)規(guī)模上的應(yīng)用[5]。

使用不同重組蛋白標(biāo)簽可對(duì)重組蛋白有不同的回收效果，在生化蛋白方面，其主要作用是提高蛋白質(zhì)產(chǎn)物進(jìn)入高質(zhì)量水平，抑制蛋白質(zhì)水解反應(yīng)，促進(jìn)目標(biāo)蛋白的折疊過(guò)程，保護(hù)抗原性集成蛋白，增強(qiáng)蛋白質(zhì)的溶解度，以及提高單鏈抗體標(biāo)記結(jié)合技術(shù)的敏感性。但是重組蛋白標(biāo)簽缺點(diǎn)是影響修飾目標(biāo)蛋白構(gòu)象（蛋白質(zhì)的溶解度和活性），降低蛋白質(zhì)產(chǎn)品的可用性，由于最終切割過(guò)程中的缺陷，抑制酶活性，改變蛋白質(zhì)的生物活性，結(jié)構(gòu)研究混亂造成不必要的蛋白質(zhì)靈活性，最后分離標(biāo)簽是昂貴的[5]。因此，快速、可靠、高性價(jià)比的重組蛋白分離純化技術(shù)是生物技術(shù)和生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的重要前提，獲得高產(chǎn)、高純度和高活性的重組蛋白對(duì)于下游不同和多種應(yīng)用是必不可少的[6]，尤其在蛋白質(zhì)純化過(guò)程中標(biāo)簽的類型、大小和位置是至關(guān)重要的選擇標(biāo)準(zhǔn)。

1.1 標(biāo)簽類型

在重組蛋白標(biāo)簽可根據(jù)性能分為兩大類。一是溶解度標(biāo)簽。這些標(biāo)簽增加了目的蛋白的溶解度，提高了靶蛋白表達(dá)和穩(wěn)定性，這種類型的標(biāo)簽主要有GST、MBP、NusA、Trx和SUMO等。二是親和標(biāo)簽。這些標(biāo)簽使用結(jié)合親和基質(zhì)捕獲目標(biāo)蛋白，主要有Poly、His、Flag、HA、Strep II、CBP1、CBD2等。在單獨(dú)使用結(jié)合親和標(biāo)簽就足以表達(dá)完全可溶性，Histag仍是使用最多的親和標(biāo)簽，無(wú)論作為單個(gè)標(biāo)簽，還是作為非傳統(tǒng)串聯(lián)親和凈化標(biāo)簽的靶向目標(biāo)[7]，它在蛋白質(zhì)檢測(cè)和結(jié)晶方面的效果已得到很好證實(shí)[8]。然而，它可以干擾蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)及功能屬性，為解決不溶性問(wèn)題，親和性標(biāo)簽有時(shí)也可作為溶度增強(qiáng)劑使用，但對(duì)于溶解度低或表達(dá)水平低的蛋白質(zhì)，應(yīng)同時(shí)使用可溶性標(biāo)簽和結(jié)合標(biāo)簽以實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)的正確表達(dá)和純化。如可通過(guò)谷胱甘肽和直鏈淀粉樹脂有效地使用結(jié)合親和力標(biāo)簽純化MBP和GST融合蛋白。

1.2 標(biāo)簽尺寸

通常選擇小標(biāo)簽是為了不容易影響目的蛋白的折疊、生物活性和免疫原性。然而，較大的標(biāo)簽由于其強(qiáng)烈的翻譯啟動(dòng)信號(hào)，可以提供更高的蛋白質(zhì)生產(chǎn)水平，此外，如果目標(biāo)蛋白體積較小，如多肽，則選擇大標(biāo)簽以防止宿主表達(dá)問(wèn)題[9]。所有的蛋白質(zhì)標(biāo)簽，無(wú)論大小，都可能對(duì)蛋白質(zhì)的生物學(xué)功能、理化性質(zhì)的改變、免疫和防止蛋白質(zhì)結(jié)晶產(chǎn)生干擾作用，因此標(biāo)簽的開發(fā)必須在蛋白質(zhì)純化的最后階段進(jìn)行，這種整合過(guò)程一直被認(rèn)為是蛋白純化成功的關(guān)鍵，這個(gè)問(wèn)題的重要性在于蛋白質(zhì)的大規(guī)模生產(chǎn)，去除與蛋白質(zhì)結(jié)合的標(biāo)簽的成本就會(huì)越來(lái)越大。融合蛋白標(biāo)簽的分離主要有3種方法，即化學(xué)法、酶法和自切割標(biāo)記，標(biāo)簽大小也取決于蛋白質(zhì)的整體構(gòu)象[1,10]。

1.3 標(biāo)簽的位置

編碼N或C端序列的基因與靶蛋白結(jié)合并最終與靶蛋白表達(dá)，通過(guò)融合標(biāo)記與靶蛋白分離純化[11]。第一步是純化與標(biāo)簽合并的蛋白質(zhì)，通過(guò)一系列蛋白酶從目標(biāo)蛋白中分離出標(biāo)簽，該技術(shù)簡(jiǎn)單可靠，可用于目的蛋白的純化，目的是保持蛋白質(zhì)的自然特性。而蛋白質(zhì)的N端/或C端要想進(jìn)行標(biāo)記，需要通過(guò)使用密切相關(guān)蛋白質(zhì)的解析結(jié)構(gòu)作為結(jié)構(gòu)模板的基于同源性的建模來(lái)進(jìn)行評(píng)估，融合蛋白連接物可用于提高純化標(biāo)記的可及性[12]。也可以使用較大的標(biāo)記代替較小的標(biāo)記，同時(shí)顯著提高其溶解度和穩(wěn)定性[13]。如果游離的（天然的）N端是蛋白質(zhì)活性的決定因素，則應(yīng)選擇C端作為標(biāo)記位置。或者，由于C端標(biāo)記更有利于高效表達(dá)，標(biāo)簽可以放置在這一端，用蛋白酶裂解，在蛋白質(zhì)的N端不留下任何或少量附加殘基，因此可以考慮作為一種成本更低的標(biāo)簽去除方式，標(biāo)簽及其裂解對(duì)蛋白質(zhì)特性的影響應(yīng)該通過(guò)功能和結(jié)構(gòu)分析評(píng)估[7]。

表1 來(lái)自不同蛋白質(zhì)純化/固定化純化標(biāo)簽

2 基于不同基質(zhì)純化標(biāo)簽蛋白

蛋白質(zhì)純化/固定標(biāo)簽可以在固體材料和生物元素之間建立特定非共價(jià)/共價(jià)相互作用的顯著能力，促進(jìn)對(duì)先進(jìn)的功能材料及下一代混合材料的創(chuàng)造。親和標(biāo)簽可與多種材料（合成、天然或混合）結(jié)合，最適合蛋白質(zhì)純化。已報(bào)道過(guò)的基質(zhì)材料有基于金屬和非金屬材料為基質(zhì)純化標(biāo)簽蛋白、基于碳基材料純化標(biāo)簽蛋白、基于聚合物/多糖材料純化標(biāo)簽蛋白、基于復(fù)合材料純化標(biāo)簽蛋白。其中，共價(jià)結(jié)合標(biāo)簽最適合長(zhǎng)期固定蛋白質(zhì)，但只能與蛋白質(zhì)材料自然結(jié)合。混合親和共價(jià)結(jié)合標(biāo)簽允許高效的一步純化和將蛋白質(zhì)固定在不同材料上，以及開發(fā)創(chuàng)新的蛋白質(zhì)工程材料。自聚集標(biāo)簽與其他標(biāo)簽組合特別有用，可用于生成具有自組裝、柔性、響應(yīng)特性的蛋白質(zhì)工程材料。雖然這些標(biāo)簽主要被探索用于獨(dú)立的蛋白質(zhì)純化、固定化或功能化目的，將標(biāo)簽介導(dǎo)的純化和固定化、功能化結(jié)合在一個(gè)步驟中的有效策略對(duì)于保證先進(jìn)蛋白質(zhì)工程材料的可持續(xù)制造至關(guān)重要。親和肽標(biāo)簽被證明對(duì)固定化/純化過(guò)程非常有用，并有望通過(guò)從其他污染物中一步回收重組蛋白作為黏附單元[34]。許多可用的親和標(biāo)簽可與目標(biāo)蛋白融合以提供親和力，從而推動(dòng)目標(biāo)蛋白固定到基質(zhì)上。

2.1 基于金屬和非金屬材料為基質(zhì)純化標(biāo)簽蛋白

常見(jiàn)的金屬和非金屬材料純化標(biāo)簽蛋白的基質(zhì)主要分為2種，即未改性的二氧化硅和裸氧化鐵顆粒，2種材料都在生物技術(shù)和生物醫(yī)學(xué)方面廣泛應(yīng)用。

二氧化硅低成本，易于提取或合成，純度非常高且可重復(fù)使用，地球資源豐富且生態(tài)友好型的一種基質(zhì)材料，可成為蛋白質(zhì)純化/固定化方案最佳選擇之一，由于表面的硅醇基團(tuán)使其表面非常通用，可用于表面化學(xué)修飾，該類特性的材料正被高度開發(fā)為替代基質(zhì)，從而為新的下游加工策略鋪平道路[35]。已報(bào)道利用二氧化硅為基質(zhì)純化目的蛋白的有通常利用綠色熒光蛋白（GFP/EGFP）[33,36-37]作為靶蛋白（圖1 SiO2純化目的蛋白示意圖），以His6、Car9、SB7、R5等標(biāo)簽純化熒光蛋白，通過(guò)該基質(zhì)提高目的蛋白的回收率及純度。還利用轉(zhuǎn)肽酶分選酶A（SrtA）通過(guò)LPXTG分選信號(hào)規(guī)范識(shí)別底物，被用于介導(dǎo)蛋白A在二氧化硅和石墨烯上的單步純化和定向固定用親核供體基團(tuán)功能化的氧化物納米顆粒，更好純化目的蛋白[38]。

圖1 以Sio2為基質(zhì)純化帶有His6標(biāo)簽的蛋白，通過(guò)吸附、分離、洗滌等步驟回收目標(biāo)蛋白示意圖[35]

裸氧化鐵顆粒低成本，通常由磁鐵礦、磁赤鐵礦、介于兩者之間的過(guò)渡態(tài)或兩種材料的混合物組成，必須在20~30 nm范圍內(nèi)才能具有超順磁性[39]。文獻(xiàn)報(bào)道的利用裸氧化鐵顆粒純化目的蛋白以綠色熒光蛋白（GFP）[20,39]、重組大腸桿菌物素連接酶[40]、ω-轉(zhuǎn)氨酶[41]、革蘭陽(yáng)性細(xì)菌巨芽孢桿菌產(chǎn)重組蛋白A[42]、生物素蛋白連接酶（BPL）與其生物素化的底物蛋白生物素羧基載體蛋白[43]作為靶蛋白，通過(guò)His6、Glu6、Q6等標(biāo)簽將蛋白固定在裸氧化鐵顆粒對(duì)目的蛋白進(jìn)行純化回收，同樣提高目的蛋白的回收率及回收的純度。

2.2 基于碳基材料純化標(biāo)簽蛋白

碳基材料主要通過(guò)非共價(jià)相互作用，屬于單步功能化材料，已報(bào)道有關(guān)碳基材料純化蛋白的文獻(xiàn)較少，Díaz-Ayala等[25]將重組HbI與聚賴氨酸標(biāo)簽Lys6融合，用于在2個(gè)碳納米管換能器表面（即粉末和垂直排列的碳納米管）上的特定位點(diǎn)共價(jià)固定，固定方式是通過(guò)2個(gè)步驟實(shí)現(xiàn)：一是從表面的羧酸基團(tuán)生成胺反應(yīng)性酯，二是將這些基團(tuán)與Lys-tag的胺基團(tuán)偶聯(lián)，因此純化目的蛋白。Tao等[44]使用不同的條件和技術(shù)分析固定化過(guò)程，以區(qū)分蛋白質(zhì)共價(jià)連接和物理吸附，即描述一種新穎的二維層狀材料（2DLM）剝離和功能化一步策略，以促進(jìn)2DLM的生產(chǎn)和性能，基于生物相關(guān)和分子吸附的實(shí)際應(yīng)用，該方法對(duì)溶解在疏水蛋白水溶液中的2DLM進(jìn)行超聲處理，在此過(guò)程中，疏水蛋白滲入夾層并自動(dòng)結(jié)合到2DLM的表面，從大塊材料中剝離單層/少層，剝離的2DLM自發(fā)包裹著致密有序的疏水蛋白單層，形成獨(dú)特的生物納米復(fù)合材料，具有大幅增強(qiáng)的生物相容性和分子吸附能力。Qafari等[38]還通過(guò)化學(xué)修飾的二氧化硅和氧化石墨烯（GO）納米粒子上的短C末端連接區(qū)域，展示分選酶A轉(zhuǎn)肽反應(yīng)的特異性對(duì)蛋白A作為模型蛋白的共價(jià)和定向附著的應(yīng)用，這種結(jié)合可在多種環(huán)境條件下發(fā)生，而不需要額外的化學(xué)反應(yīng)。

2.3 基于聚合物/多糖基材料純化標(biāo)簽蛋白

已報(bào)道有關(guān)聚合物/多糖為材料純化蛋白的材料眾多，大多數(shù)聚合物是以樹脂為載體對(duì)目的蛋白進(jìn)行純化，如Khairil等[45]和Keeble等[46]利用SpyDock樹脂，通過(guò)合理的工程設(shè)計(jì)，可以捕獲SpyTag標(biāo)簽融合并允許高效洗脫目的蛋白。葡聚糖凝膠G-100樹脂也是一種聚合物材料載體，Wu等[18]利用葡聚糖結(jié)合結(jié)構(gòu)域?qū)⒐こ替溍褂H和素固定到葡聚糖凝膠上的生物偶聯(lián)方法，具有可逆生物素結(jié)合能力的工程化鏈霉親和素（SAVSBPM18）已成功應(yīng)用于純化生物素化和鏈霉親和蛋白結(jié)合肽（SBP）標(biāo)記的蛋白質(zhì)，產(chǎn)生的親和柱有效地純化SBP標(biāo)記的和生物素化的蛋白質(zhì)。Im7樹脂是一種典型的標(biāo)簽介導(dǎo)的單步純化蛋白質(zhì)工程先進(jìn)材料，Vassylyeva等[6]通過(guò)Im7樹脂基質(zhì)材料，通過(guò)突變CE7標(biāo)簽構(gòu)建CL7標(biāo)簽，采用的方法就是一步純化復(fù)雜蛋白質(zhì)的高效超高親和層析，由于蛋白質(zhì)純化需要一個(gè)高效的凈化標(biāo)準(zhǔn)，因此，該標(biāo)簽保持與Im7的完全結(jié)合的親和力。肝素瓊脂糖樹脂和Im7樹脂有相似之處，都是采用親和層析，親和層析是純化在不同表達(dá)宿主中表達(dá)的重組蛋白的一種廣泛使用的方法[47]，AlfA選擇樹脂同樣是一種蛋白質(zhì)工程先進(jìn)材料，它的特點(diǎn)源自設(shè)計(jì)標(biāo)簽的廣泛性，G?tzke等[14]利用納米抗體結(jié)合來(lái)自天然或固定標(biāo)本的ALFA標(biāo)簽蛋白，具有低皮摩爾親和力。另外，利用多糖為基質(zhì)純化目的蛋白主要包括纖維素、殼聚糖及淀粉。纖維素是最豐富的植物細(xì)胞壁多糖，其解構(gòu)需要大量微生物酶的協(xié)同作用。Pires等[48]利用的模塊化纖維素酶包含非催化A型碳水化合物結(jié)合模塊（CBM），A型CBM標(biāo)簽在纖維素回收中起關(guān)鍵作用，含有特異性結(jié)合纖維素的結(jié)晶區(qū)域，從而通過(guò)接近和靶向效應(yīng)提高酶的功效。

2.4 基于復(fù)合材料純化標(biāo)簽蛋白

復(fù)合材料是基于納米或分子尺度上對(duì)蛋白進(jìn)行固定純化，被廣泛應(yīng)用于生物技術(shù)、生物醫(yī)藥等方面。目前報(bào)道與復(fù)合材料結(jié)合的標(biāo)簽主要以His6及SBP、CBM等。如甲基汞（MeHg）化合物可以自然形成，具有劇毒，某些細(xì)菌已經(jīng)進(jìn)化出能夠耐受甲基汞的機(jī)制，因此，Mccarthy等[49]通過(guò)對(duì)甲基汞化合物進(jìn)行去甲基化，從質(zhì)子分解反應(yīng)中由單一有機(jī)汞裂解酶控制的去甲基化機(jī)制的啟發(fā)，使用產(chǎn)生這種裂解酶的重組基因加上選擇性結(jié)合沸石顆粒的額外多肽SBP，有效地將酶束縛在固體基質(zhì)上。Zhou等[50]合成一種高效便捷的用于純化和固定His標(biāo)記的β-葡萄糖苷酶的Fe3O4/PM-G/IDA-Ni2+納米顆粒，采用蒸餾-沉淀聚合法合成核/殼微球，用亞氨基二乙酸（IDA）打開微球殼上的環(huán)氧環(huán)以結(jié)合Ni2+（圖2），固定化的β-葡萄糖苷酶可多次循環(huán)利用，并保留原有活性的65%以上，該材料在酶的純化和固定化方面顯示出巨大潛力。Dhar等[51]利用一種仿生復(fù)合材料，該復(fù)合材料使用基于彈性蛋白的雜化蛋白聚合物，具有用于還原氧化石墨烯（RGO）和納米原纖化纖維素（NFC）的選擇性結(jié)合順序，融合蛋白的黏合和彈性結(jié)構(gòu)域，顯示出協(xié)同效應(yīng)，同時(shí)提高合成珍珠層的強(qiáng)度和韌性，用于工程蛋白質(zhì)的生物合成途徑，為開發(fā)具有所需特性的材料提供新前景。

圖2 基于Fe3O4/PMG/IDA納米材料的制備及其結(jié)合蛋白示意圖[50]

3 結(jié)語(yǔ)與展望

蛋白質(zhì)工程材料的出現(xiàn)對(duì)蛋白質(zhì)純化過(guò)程提供參考，可認(rèn)為是一種材料科學(xué)的未來(lái)?；诟信d趣的肽、蛋白質(zhì)特異性連接到有機(jī)或無(wú)機(jī)材料表面的標(biāo)簽的單步純化和固定方法為一系列不同的新型蛋白質(zhì)、肽應(yīng)用開辟了道路，通過(guò)該方法，在蛋白質(zhì)純化過(guò)程中蛋白質(zhì)標(biāo)簽是關(guān)鍵，并顯示出在基于錨肽、蛋白質(zhì)純化技術(shù)方面的巨大潛力，它們可單獨(dú)使用，或與其他肽或蛋白質(zhì)結(jié)合，作為共價(jià)或非共價(jià)接頭用于材料表面功能化，而不影響材料的性質(zhì)或干擾融合伴侶。開發(fā)此類材料所需的蛋白質(zhì)、肽的可持續(xù)供應(yīng)依賴于重組蛋白質(zhì)的生產(chǎn)及在過(guò)去幾年中已顯著發(fā)展的純化和固定化技術(shù)，標(biāo)簽介導(dǎo)的蛋白質(zhì)純化、固定化策略成為傳統(tǒng)化學(xué)固定化方法的環(huán)保且具有成本效益的替代方案，允許在一個(gè)步驟中將蛋白質(zhì)、肽結(jié)合純化和固定化到天然、合成或雜合材料上，簡(jiǎn)化蛋白質(zhì)工程材料的制造過(guò)程，因此，基于不同基質(zhì)材料純化重組蛋白的方案有待進(jìn)一步深入探索。