牛肝菌對動物腸道微生物的影響

劉曉雪，奚楚瑜，李文杰，張苒嬌，田洋, ，宋爽,

1.云南農(nóng)業(yè)大學食品科學技術學院（昆明 650201）；2.國家辣木加工技術研發(fā)專業(yè)中心（昆明 650201）；3.云南省生物大數(shù)據(jù)重點實驗室（昆明 650201）

牛肝菌多分布于云南，是牛肝菌科和松塔牛肝菌科等真菌的統(tǒng)稱，其滋味鮮美，營養(yǎng)豐富，具有一定的食用價值和藥用價值，同時也是一種世界性著名食用菌。由于其具有多種抗病的藥用保健價值，眾多學者逐漸由食用擴大轉入到藥用研究及藥用開發(fā)研究[8-9,11]。

益生元（prebiotics）作為一類膳食補充劑，種類繁多，生產(chǎn)商品化的主要是一些有雙歧因子功能的低聚糖[4]。同時其對雙歧桿菌等益生菌有促進作用，研究表明益生元功效包括：非消化性和低熱量；減輕便秘；調(diào)節(jié)腸內(nèi)微生物菌群的平衡，增強免疫促進有益菌群（雙歧桿菌等），抑制有害菌群（沙門菌等）[3]。

隨著生活水平的提高，人們更注重健康飲食，在食品或飲料中添加可以促進雙歧桿菌生長的低聚糖，刺激腸道內(nèi)原有雙歧桿菌和乳酸桿菌的生長繁殖，有助于增強自身免疫和機體健康[6]。該試驗采用熒光定量PCR技術對食用牛肝菌的小鼠菌群進行分析，研究其對動物腸道微生物的益生作用及對益生菌群的影響作用。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

昆明鼠（湖南斯萊克實驗動物有限公司）；益生元（合生元）；糞便DNA提取試劑盒（Solarbio公司）；實時熒光定量試劑盒（Takara，Code No.638319）；瓊脂糖凝膠電泳槽（BIO-RAD公司）；1 mL注射器（浙江康德萊醫(yī)療器械股份有限公司）；滅菌水；dd水（Solarbio公司）；引物（上海捷瑞生物工程有限公司）。

1.2 儀器與設備

StepOnePlusTM實時熒光定量PCR儀（美國運用生物系統(tǒng)公司）；3K15高速離心機（上海安亭科學儀器廠）；PowerPacTM Basic電泳儀（BIO-RAD）；BP121S電子天平（Stertorius公司）。

1.3 方法與步驟

1.3.1 試驗動物分組及處理

試驗小鼠隨機分成3組，分別為陽性對照組（灌胃益生元溶劑）、試驗組（灌胃牛肝菌粉末溶液），空白試驗組（灌胃生理鹽水）每組6只，試驗期間各組小鼠每日灌胃0.4 mL樣品，連續(xù)7 d，分別采取試驗動物第1天和第5天試驗動物的新鮮糞便于自封袋中，放于-80 ℃冰箱中保存。

1.3.2 糞便細菌DNA的提取

根據(jù)諾唯贊DNA Extraction Kit（Prepackaged）試劑盒說明書提取糞便細菌中的DNA。

1.3.3 DNA濃度及純度檢測

制膠：稱取1 g瓊脂糖置于錐形瓶中，加100 mL 1×TAE溶液，加熱至瓊脂糖全部融化。

加樣：將10 μL DNA樣品與2 μL的Loading buffer混合，取10 μL加入小槽內(nèi)，第一格用Marker作對照。

電泳：120 V 60 min，溴酚藍移動到距離膠板下緣1 cm處時，停止電泳。

觀察：在紫外燈下進行觀察，DNA存在則顯示出紅色熒光條帶，采用凝膠成像系統(tǒng)拍照保存。

1.3.4 標準菌模板DNA的制備

收集培養(yǎng)好的標準菌新鮮菌體，使用DNA提取試劑盒提取DNA，且DNA產(chǎn)物應保存在-20 ℃，以防止DNA的降解。

1.3.5 PCR引物的設計

參考文獻設計引物序列[1,15]，如表1所示，Real-time PCR法采用的引物序列、退火溫度、擴增片段大小。

表1 引物序列名稱

1.3.6 SYBR Green實時熒光定量PCR的建立

將提取好的DNA按照SYBR Green實時熒光定量PCR試劑盒進行熒光定量PCR試驗[5]。

按照反應體系將配好試劑的8排管按照設計好的順序平整放置于實時PCR儀中。根據(jù)程序完成PCR反應，于2 h后觀察試驗結果。

1.3.7 標準曲線的制作

收集培養(yǎng)好的標準菌新鮮菌體，采用相同的方法試劑盒提取DNA，將得到的DNA樣品用無菌TE稀釋10倍，用紫外分光光度計測定A260nm，計算DNA濃度，并根據(jù)每種細菌基因組大小計算相應模板數(shù)，以標準品模板數(shù)的對數(shù)為橫坐標，PCR反應過程中出現(xiàn)熒光信號的初始循環(huán)數(shù)（Ct）為縱坐標即可做標準曲線。

1.3.8 待測糞便樣品

將糞便樣品中提取的DNA分別進行2種細菌的DNA熒光定量PCR反應，反應體系和條件與標準曲線制備時完全相同。反應完畢后根據(jù)熔解曲線分析PCR產(chǎn)物的特異性。

1.4 數(shù)據(jù)處理

每個試驗重復3次，試驗結果用均數(shù)±標準差表示。數(shù)據(jù)結果采用Excel 2007軟件進行分析，帶入Graphpad prism5軟件進行繪制柱形圖和分析顯著性差異。

2 結果與分析

2.1 標準曲線

其拷貝數(shù)=（6.023×1023×DNA濃度）/（660×堿基對數(shù)），計算出每微升的拷貝（見表2、表3），稀釋為5個濃度梯度其拷貝數(shù)的對數(shù)值作為橫坐標，PCR反應過程中出現(xiàn)熒光信號的初始循環(huán)數(shù)（Ct）的平均值為縱坐標即可做標準曲線。

表2 雙歧桿菌標準曲線數(shù)據(jù)

表3 乳酸桿菌標準曲線數(shù)據(jù)

雙歧桿菌、乳桿菌的標準曲線如圖1和圖2所示。結果顯示：雙歧桿菌標準曲線方程為y=-2.59x+43.996，相關系數(shù)R2=0.988 1；乳桿菌的標準曲線方程為y=-3.1x+39.048，相關系數(shù)R2=0.978 6。

圖1 雙歧桿菌標準曲線

圖2 乳酸桿菌標準曲線

2.2 引物特異性檢測

擴增曲線是PCR動態(tài)過程中的曲線，呈S型。其中，對數(shù)期是熒光信號指數(shù)擴增的階段，PCR產(chǎn)物量的對數(shù)值與起始模板量之間存在線性關系。其用于表示不同拷貝數(shù)的模板循環(huán)數(shù)與熒光強度的關系，分為基線期、對數(shù)期及平臺期3個階段。通過實時熒光定量進行實時監(jiān)測可得到標準品DNA擴增圖和樣品熔解曲線見圖3~圖6。

圖3 雙歧桿菌DNA樣品定量PCR擴增圖

圖4 雙歧桿菌DNA樣品定量PCR擴增熔解曲線

圖5 乳桿菌DNA樣品定量PCR擴增圖

圖6 乳酸桿菌DNA樣品定量PCR擴增熔解曲線

從PCR擴增熔解曲線中可以看出，乳酸桿菌只有1個峰值說明其引物的特異性良好，而雙歧桿菌出現(xiàn)2個峰值說明其特異性不是很好，存在原因可能是引物濃度太大[12]。從擴增圖可看出，DNA模板隨著循環(huán)數(shù)增加，其熒光強度不斷增，在PCR擴增圖中找到相對應的樣品的Ct值并取三者的平均數(shù)，如表4和表5所示。

表4 引物乳酸桿菌未知樣品Ct值

表5 引物雙歧桿菌未知樣品Ct值

通過將未知樣品的Ct值帶入到相應標準曲線中對未知樣品進行比對，如表6和表7所示。陽性對照組（益生元試驗組）的對數(shù)轉換后的拷貝數(shù)高于試驗組及空白對照組，且第5天的樣品的拷貝數(shù)高于第1天樣品的拷貝數(shù)，就試驗組的拷貝數(shù)而言，其第5天的數(shù)據(jù)同樣高于第1天樣品的拷貝數(shù)，說明小白鼠在灌胃前后腸道內(nèi)的微生物發(fā)生一定變化，通過連續(xù)灌胃牛肝菌使得體內(nèi)乳酸桿菌和雙歧桿菌的數(shù)量增多，通過與空白試驗組進行對照，進一步說明牛肝菌的益生作用，其對動物腸道內(nèi)的有益微生物具有一定促進作用。

表6 乳酸桿菌的拷貝數(shù)

表7 雙歧桿菌的拷貝數(shù)

3 結論與討論

牛肝菌由于其食味香甜可口，營養(yǎng)豐富，是一種世界性著名食用菌。牛肝菌越來越受到重視，其具有極高的經(jīng)濟效益和社會效益，而試驗結果也為野生菌開發(fā)研究提供一定參考。

實時熒光定量PCR檢測是一種能夠和特異性的雙鏈DNA結合的熒光染料，在反應過程中，隨著PCR產(chǎn)物增加，PCR產(chǎn)物與SYBR Green結合的量也隨之增大[13]，二者結合后形成的熒光信號可被儀器檢測到，通過對已知拷貝數(shù)的不同稀釋倍數(shù)的陽性模板做熒光定量PCR，可做標準曲線，未知樣品通過與標準曲線比較即可得出定性及定量結果。

為驗證配制體系的試劑是否污染可以設定一個無模板的陰性對照做進一步驗證。所以在試驗前應進行大量預試驗確定最佳參數(shù)和工藝。