野生靈芝生物學特性及種子液發酵時間對出芝的影響

紀偉 ，劉曉梅，蘇文英，任立凱，胡曙鋆，陳克龍

1.連云港市農業科學院（連云港 222000）；2.連云港市園藝蔬菜指導站（連云港 222000）；3.青海師范大學（西寧 810000）

靈芝在廣義上是靈芝屬（Ganoderma lingzhi）的總稱，是一種大型食藥用真菌[1]，有“仙草”“瑞草”等美稱，是馳名中外的珍稀中藥材之一[2]，在日本、巴基斯坦和其他一些國家及地區均有發現[3]，根據生物多樣性信息數據庫（Global Biodiversity Information Facility，GBIF）檢索及分析，在已上傳的8 179個數據中，除了南極洲，其他六大洲均有發現，歐洲上傳的靈芝樣本數據最多。

靈芝具有豐富的藥理成分，且無毒副作用，有效成分包括靈芝多糖[4]、多肽[5]、三萜類[6]及16種氨基酸[7]等。靈芝能降低中樞神經系統的興奮性，有一定鎮痛作用[8]，有解毒[9]、降血糖[10]及抗輻射[11]等效應，靈芝多糖更是能提高機體免疫力[12]，有一定治療哮喘[13]和抗腫瘤作用[14]。靈芝還擁有極高的文化觀賞價值[15]，自古被人視為吉祥、富貴之物，可將之培育成外形美觀的觀賞植物[16]。

花果山位于江蘇省連云港市南云臺山中麓[17]，是江蘇省諸山的最高峰[18]，是連云港市生物多樣性、豐富性和典型性代表區域之一，區域內具有豐富的野生菌物資源，尤其以野生靈芝資源最為豐富。通過對連云港花果山采集的野生靈芝進行分離、ITS分子鑒定、靈芝菌株生物學特性及種子液發酵時間對出芝的影響研究，在加強野生靈芝資源研究和保護的基礎上，挖掘優質種質資源，為靈芝在食品工業的產品開發提供一定參考。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

菌株來源：于2021年9月在連云港市花果山（北緯34°62′493′，東經119°27′808′）采集獲得，標本編號lynk2103。將采集的野生靈芝進行組織分離得到菌株，保存于連云港市農業科學院食用菌種質資源庫。

馬鈴薯葡萄糖水培養基、馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養基、酵母浸粉、磷酸二氫鉀、無水硫酸鎂、蔗糖、D（+）-麥芽糖、蛋白胨、瓊脂糖等。

YDS-10-80液氮罐（樂山市東亞機電工貿有限公司）；凝膠成像系統（上海培清科技有限公司）；PCR儀（德國Eppendorf公司）；CX43顯微鏡（日本Olympus公司）；超凈工作臺（德國Airtech）；MD-550離心機（德國Eppendorf公司）。

1.2 野生靈芝菌株分離及保存

記錄野生靈芝的生境及其形態特征，寄生的植被的位置，子實體的形狀、顏色、輪紋、菌蓋厚度和菌肉顏色等形態特征。采用組織分離法，選取幼嫩未散粉野生靈芝子實體，用含有75%酒精濃度的酒精棉球擦拭靈芝菌蓋表面，滅菌后的手術刀切除表層，再用滅菌后的鑷子夾取內部組織，接種于PDA平板上，于25 ℃暗培養5 d，挑取萌發的菌絲，獲得純培養菌株，將菌絲接種于PDA試管斜面上，待斜面長滿置于4 ℃冰箱保存。

1.3 菌株的ITS分子鑒定

采用康維世紀真菌基因組DNA快速提取試劑盒提取DNA，提取的DNA進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，采用真菌通用引物ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）和ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）進行PCR擴增，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。擴增條件為94 ℃預變性5 min，94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，35個循環，72 ℃延伸10 min。PCR產物交由生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序，所測得ITS序列與GenBank數據庫進行Blast比對，采用軟件MEGA 7.0對所測ITS序列進行比對、近鄰相接法（neighbor-joining method，NJ）構建系統發育樹[19]。

1.4 液體培養基碳氮源篩選

以20 g/L的葡萄糖、蔗糖、淀粉、麥芽糖和甘露醇為液體培養基的唯一碳源，以10 g/L的蛋白胨、硝酸鉀、硝酸銨、硝酸鈉和硫酸銨為液體培養基的唯一氮源，在pH 6.8~7.0、25 ℃，160 r/min條件下避光培養，分別探究不同碳氮源對靈芝菌株液體發酵產生的生物量（菌絲體干重）的影響。

液體發酵菌絲體干重的測定方法：量取50 mL靈芝發酵液倒入離心管中，以10 000 r/min離心5 min，將離心后獲得的菌絲體轉移到恒重的稱量瓶中，于80℃烘干，稱定，計算其菌絲體干重，每個試驗設定2個重復。

1.5 液體發酵條件單因素試驗

將發酵液分別放置于轉速為50，100，150，200和250 r/min的恒溫振蕩器中培養，考察轉速對靈芝菌株液體發酵產生的生物量（菌絲體干重）的影響；將發酵液分別放置于溫度為15，20，25，30和35 ℃的恒溫振蕩器中培養，考察溫度對靈芝菌株液體發酵產生的生物量（菌絲體干重）的影響；在500 mL搖瓶中將發酵液裝液量分別設定為50，100，15，200和250 mL，考察搖瓶裝液量對靈芝菌株液體發酵產生的生物量（菌絲體干重）的影響；將發酵液接種量分別設置為2%，4%，6%，8%和10%，考察接種量對靈芝菌株液體發酵產生的生物量（菌絲體干重）的影響，每個試驗設定2個重復。

1.6 液體培養基配方不同因素和水平正交試驗

培養溫度25 ℃，初始pH自然，接種量5%、接種菌齡5 d，搖床轉速160 r/min，無水硫酸鎂與磷酸二氫鉀含量均為1 g/L，選定常規和適于規模化生產的碳源、氮源和無機鹽，進行3個因素4個水平[L16(43)]正交試驗設計考察，具體設計見表1。統計發酵液中菌絲體干重，以此為考察指標，經統計學分析，找出最優配方。

表1 液體培養基的L16(43)正交試驗設計 單位：g/L

1.7 液體發酵過程曲線

以篩選出的最優碳源、氮源、最佳發酵條件和最優培養基配方來探究靈芝菌株液體發酵過程中生物量（菌絲體干重）、pH和胞外多糖含量變化規律，每10 h取1次發酵液進行測定，取樣16次，每個試驗設定2個重復。

液體發酵液pH測定方法：在超凈臺中，無菌操作取樣發酵液15 mL于50 mL燒杯中，使用pH計進行測定，測定前pH計需要校準。

液體發酵胞外多糖測定：使用100 mL離心管取樣發酵液25 mL，每個試驗設定2個重復，向裝有發酵液的每個離心管中加入無水乙醇75 mL，震蕩后靜置12 h，使用離心機以10 000 r/min離心5 min，倒掉上清液，收集沉淀，使用70 ℃烘干，稱定，計算其胞外多糖含量[20]。

1.8 液體菌種不同發酵時間菌絲吃料速度及對出芝影響

選取不同發酵時間的種子液，時間為90~160 h，每10 h作為1個試驗組，分別接種至固體培養基中，測定菌絲吃料速度和滿袋時間，每個試驗設定2個重復，并記錄最后靈芝子實體出芝情況。

1.9 統計方法

采用SPSS和Excel軟件對數據處理分析，采用Duncan新復極差法對組間差異顯著性進行分析，以P＜0.05為差異具有統計學意義，采用Photoshop軟件處理圖片，利用Origin 9.1軟件對所得數據作圖，采用MEGA 7.0對ITS序列構建系統發育樹。

2 結果與分析

2.1 野生靈芝分離及保存

由圖1（A）可知，野生靈芝菌株生境植被主要為麻櫟、板栗等闊葉樹種。由圖1（B和C）可知，幼嫩靈芝子實體近半圓形，成熟靈芝子實體近圓形，菌蓋較厚，輪紋明顯，半徑3.6~6.4 cm；菌柄紅褐色，側生，長度4.5~10.7 cm，幼嫩子實體菌蓋邊緣淡黃色，邊緣肥厚。由圖1（D）可知，在PDA培養基中菌落近圓形，菌落中心菌絲有凸起輪紋、菌落周邊菌絲表面平整，菌絲色澤為白色，菌絲平伏、濃密、均勻，無白色氣生菌絲。由圖1（E）可知，通過奧林巴斯顯微鏡觀察發現菌絲粗壯，分枝密度不高，有隔膜，可見鎖狀聯合，無雜菌。分離獲得的菌株使用試管斜面（見圖1 F），菌株命名為lynk2103，保存于4 ℃冰箱。

圖1 野生靈芝子實體及菌落形態

2.2 菌株lynk2103的ITS分子鑒定

經PCR擴增和凝膠電泳檢測，獲得 ITS序列片段612 bp，如圖2所示。由電泳圖結果中可以看到條帶介于500~750 bp之間，與ITS測序結果一致，測序數據已上傳至NCBI數據庫中，GenBank登錄號為OP784796。測序結果在GenBank中進行Blast比對，可以判定菌株lynk2103為Ganoderma lingzhi。使用鄰位相連法構建系統發育樹。從進化樹可以看出，根據分支信息lynk2103與已報道靈芝近交程度較低。

圖2 靈芝ITS序列DNA電泳圖和系統發育樹

2.3 液體培養基碳氮源篩選

由圖3可知，在不同碳源（葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、甘露醇和淀粉）的培養下，菌株lynk2103的液體發酵產生的生物量（菌絲體干重）呈先增加后平穩趨勢，碳源為葡萄糖時，液體發酵產生生物量最多（菌絲體干重），達到12.34 g/L，培養5 d的發酵液開始進入平穩期；麥芽糖和蔗糖作為碳源時，液體發酵產生生物量次之；隨后依次為淀粉和甘露醇。故選擇葡萄糖作為碳源。

圖3 碳源和氮源對菌株lynk2103發酵的影響

在不同氮源（蛋白胨、硝酸鉀、硝酸鈉、硝酸銨和硫酸銨）的培養下，菌株lynk2103的液體發酵產生的生物量（菌絲體干重）呈先增加后平穩趨勢，氮源為蛋白胨時，液體發酵產生生物量最多（菌絲體干重），達到11.94 g/L，培養6 d的發酵液開始進入平穩期；硝酸銨作為氮源時，液體發酵產生生物量次之；隨后依次為硝酸鉀和硝酸鈉；硫酸銨作為氮源時液體發酵產生生物量最少。故選擇蛋白胨作為氮源。

2.4 液體發酵條件單因素試驗

由圖4可知：靈芝液體發酵的最佳轉速為150 r/min，對應菌絲體干重達10.50 g/L，較轉速200和250 r/min對應菌絲體干重分別提高1.89%和8.76%，差異不顯著，但顯著高于轉速100和50 r/min對應菌絲體干重（P＜0.05）；靈芝液體發酵的最佳接種量為10%，對應菌絲體干重達10.55 g/L，顯著高于其他4種接種量對應的菌絲體干重（P＜0.05），較菌絲體干重第二高的8%接種量提高10.70%；靈芝液體發酵的500 mL搖瓶的最佳裝液量為100 mL，對應菌絲體干重達10.45 g/L，較菌絲體干重第二高的裝液量150 mL提高3.36%，差異不顯著，但顯著高于其他3種裝液量對應菌絲體干重（P＜0.05）；靈芝液體發酵的最佳溫度為30 ℃，對應菌絲體干重達11.18 g/L，顯著高于其他4種發酵溫度對應的菌絲體干重（P＜0.05），較菌絲體干重第二高的25 ℃發酵溫度提高12.88%。

圖4 靈芝菌株lynk2103的液體發酵菌條件優化

2.5 靈芝菌株lynk2103的液體培養基配方不同因素和水平正交試驗

由表2可知：因素A（葡萄糖）極差R值最大為3.31，其次是因素C（蛋白胨）極差R值為3.23，因素B（酵母浸粉）極差R值最小為0.78，說明培養基成分對靈芝液體發酵產生生物量（菌絲體干重）的影響大小順序為葡萄糖含量＞蛋白胨含量＞酵母浸粉含量；因素A（葡萄糖）4水平數據的綜合平均最高為10.83，因素B（酵母浸粉）2水平數據的綜合平均最高為9.44，因素C（蛋白胨）3水平數據的綜合平均最高為10.42，說明最優水平為A4B2C3，即葡萄糖40 g/L、酵母浸粉10 g/L、蛋白胨15 g/L加上固定的磷酸二氫鉀1 g/L、無水硫酸鎂1 g/L，為該正交試驗最優發酵配方。

表2 L16(43)正交試驗結果

2.6 優化后靈芝菌株lynk2103的液體發酵菌過程曲線

經160 h的發酵培養，結果如圖5所示。根據菌絲體干重變化曲線可知，0~50 h為遲緩期，50~130 h為對數生長期，130~150 h為平穩期，而從150 h開始進入衰亡期。在150 h靈芝生物量（菌絲體干重）達到最高為18.19 g/L；根據發酵液pH和胞外多糖變化曲線可知，發酵液pH隨著發酵時間的延長而降低，與菌絲體干重變化存在一定的負相關，pH從150 h開始趨于穩定。根據菌絲體干重和pH發酵過程曲線的規律，可作為調控發酵的依據。

圖5 靈芝菌株lynk2103的原種液體發酵過程曲線

2.7 液體菌種不同發酵時間菌絲吃料速度及對出芝影響

選取不同發酵時間的種子液分別接種至固體培養基中，測定菌絲吃料速度和滿袋時間，如圖6所示，因液體菌種不同的發酵時間菌絲濃度不同，對菌絲吃料速度和菌袋長滿時間產生影響。液體發酵時間120 h時，菌絲吃料速度最高，吃料速度為0.56 cm/d，其次是110 h，液體發酵時間90 h對應的吃料速度最低為0.40 cm/d，其中液體菌種發酵時間110和120 h對應的吃料速顯著高于發酵時間90 h對應的吃料速度（P＜0.05）。對菌袋長滿時間進行統計，液體菌種發酵時間90 h長滿菌袋時間最長為35 d，顯著長于其他組別（P＜0.05），菌袋長滿時間與前期菌絲吃料速度有一定的對應關系，但不完全一致。

圖6 液體菌種不同發酵時間菌絲吃料速度和滿袋時間

不同發酵時間種子液因菌絲濃度的影響，菌絲吃料速度和固體培養基滿袋時間存在著差異，但后期對子實體的形成影響并不大，如圖7所示，不同發酵時間的種子液對應的出芝情況，均可以正常形成靈芝子實體，從經濟角度考慮種子液發酵時間應選擇菌絲生長速度快和滿袋時間最快的參數，菌株lynk2103對應最佳發酵時間為120 h。

圖7 液體菌種不同發酵時間靈芝子實體出芝情況

3 討論

通過對采集的野生標本進行形態學鑒定及分離后的菌株進行ITS分子鑒定，確定菌株lynk2103為靈芝屬真菌。從進化樹可以看出，根據分支信息lynk2103與已報道靈芝近交程度較低，說明該菌株具有較好的遺傳多樣性，測序數據已上傳至NCBI數據庫中，GenBank登錄號為OP784796，菌絲具有鎖狀聯合，說明為雙核菌絲，具備子實體形成條件。在碳源對靈芝液體發酵產生生物量影響的研究發現葡萄糖是該菌株最優碳源，這與邢源月等[21]研究結果存在一定差異，這可能因為不同菌株在不同碳源利用效率方面存在一定差異所致，葡萄糖是一種單糖，是傳統的速效碳源，采購方便，價格低廉，更有利于生產推廣。氮源對靈芝液體發酵產生生物量影響研究發現有機氮源和無機氮源均可以被該菌株利用，蛋白胨是該菌株最優氮源，有機氮源效果更佳，這可能與有機氮源中還含有一定的微量元素和其他營養成分有關。

液體發酵條件單因素試驗研究發現：靈芝液體發酵的最佳轉速為150 r/min，最佳接種量為10%，這與多數食藥用真菌要求一致；最佳裝液量為100 mL，對應菌絲體干重達10.45 g/L，較菌絲體干重第二高的裝液量150 mL提高3.36%，差異不顯著，但顯著高于其他3種裝液量對應菌絲體干重（P＜0.05），如果從生產效率角度考慮，可采用150 mL的裝液量，同時也說明靈芝發酵過程耗氧量較高，在工業化發酵罐發酵靈芝液體菌種時需要提高發酵的通氣比；靈芝液體發酵的最佳溫度為30 ℃，相較于其他食用菌最佳發酵溫度25 ℃要高，這與野生靈芝在夏季高溫季山林中最為豐富剛好對應，另外劉月琴等[22]發現靈芝在發酵溫度32℃時可以提高靈芝活性成分黃酮的含量與本試驗結果類似。

靈芝菌株液體發酵配方正交試驗研究中發現培養基成分對靈芝液體發酵產生生物量的影響順序為葡萄糖含量＞蛋白胨含量＞酵母浸粉含量，說明碳源是首要影響因素，同時發現過高或過低的氮源均不利于靈芝菌絲體的合成，這可能是因為氮源過低時候很快被消耗，而氮源過高時一方面改變了培養基碳氮比，另一方面濃度過高影響滲透壓，而不利于靈芝發酵液生物量的積累，通過正交試驗科學的確定菌株lynk2103的最佳配方。

在優化后的條件下，通過對菌株lynk2103的液體發酵過程進行跟蹤，根據發酵液生物量變化曲線發現在150 h靈芝生物量（菌絲體干重）達到最高為18.19 g/L，高于何偉等[23]研究結果；根據發酵液pH變化曲線可知，發酵液pH隨著發酵時間的延長而降低，與菌絲體干重變化存在一定的負相關，根據菌絲體干重和pH過程曲線的規律，可作為發酵終點的綜合判定和發酵過程調控的依據[24]，另外菌絲體在培養過程由于新陳代謝產生的有機酸積累，對菌絲體的生長起到一定的抑制作用，因此菌絲體發酵起始pH要適當調高，已報道對發酵初始pH的研究主要在酸性及中性條件下，唐晨旻等[25]探究靈芝在初始pH 2~11較廣范圍內的發酵情況，通過試驗發現發酵后菌絲體干重最高在初始pH為10，賀新生等[26]報道樹舌靈芝菌絲體發酵的最適宜pH為8.5，這些現象均與此次研究的試驗現象相吻合。

不同發酵時間種子液因菌絲濃度不同影響菌絲在固體培養基中的生長速度，但并不是菌絲濃度越高，菌絲在固體培養基中速度越快[27]，所以在菌種發酵時間選擇上，一方面需要參照液體菌種發酵曲線，另一方面還要考慮菌絲在固體中吃料速度，菌絲濃度過高或者過低都對菌絲生長速度有影響，菌絲量過低，菌絲在固體培養基中的生長點過少，菌絲量過高，老化菌絲較多，菌種活力不夠[28]，試驗中靈芝菌株對應的最佳發酵時間為120 h，不僅吃料速度快，而且滿袋時間最短。另外，試驗發現不同發酵時間的種子液對出芝情況影響較小，但對后期代謝產物含量、子實體生物量和產孢量仍需進一步研究。

4 結論

此次研究采集分離獲得的菌株lynk2103通過形態學和ITS基因序列分析，確定菌株為靈芝屬真菌，測序數據上傳至NCBI數據庫中，GenBank登錄號為OP784796，從進化樹可以看出，lynk2103與已報道靈芝近交程度較低，說明該菌株具有較好的遺傳多樣性，菌絲具有鎖狀聯合，說明為雙核菌絲，具備子實體形成條件；液體培養基最佳碳源為葡萄糖，最佳氮源為蛋白胨；液體發酵的最佳轉速150 r/min，最佳接種量10%，最佳裝液量100 mL和最佳發酵溫度30 ℃，最佳培養基配方為葡萄糖40 g/L、酵母浸粉10 g/L、蛋白胨15 g/L、磷酸二氫鉀1 g/L和無水硫酸鎂1 g/L；原種發酵曲線0~50 h為遲緩期，50~130 h為對數生長期，130~150 h為穩定期，150 h開始進入衰亡期，發酵液pH與菌絲體干重變化呈負相關；靈芝菌株液體發酵最佳時間為120 h，不僅吃料速度快，而且滿袋時間最短，不同發酵時間的種子液對菌絲吃料速度和固體培養基滿袋時間存在著差異，但對出芝情況影響較小。