豌豆酸漿中淀粉絮凝菌的篩選及其絮凝性質分析

劉嬌，李源，王佳瑤，張莉力，顧英，許云賀

錦州醫科大學食品與健康學院（錦州 121000）

酸漿法生產淀粉在我國已有數百年的歷史，酸漿是將豆類磨碎成淀粉乳后放置一段時間經微生物自然發酵，形成的一種淡黃色酸性液體[1]。酸漿中微生物的絮凝作用致使淀粉顆粒迅速形成大的絮凝團，從而加快淀粉與蛋白質、纖維素等雜質的分離。用酸漿法生產的淀粉被認為比用離心等其他方法生產的淀粉更適合制作傳統的東方食品粉絲[2]。這種傳統的酸漿發酵方法仍在中國淀粉生產中占主導地位[3]。豌豆淀粉由于來源廣泛，價格便宜且成膠能力強、凝膠制品色澤好、持水性好等其他淀粉無法比擬的優點，被用于制作粉絲、粉皮、涼粉等傳統食品[4]。酸漿中的微生物類群對有效提升酸漿法的生產效率起關鍵性作用。但是很多因素限制了酸漿法在實際生產中的應用，如環境因素會導致酸漿的酸度不易控制，酸漿中的腐敗雜菌也會致使不同批次淀粉產品的質量各不相同。所以若將酸漿的生產由自然發酵改變為純種發酵，將會解決眾多豌豆淀粉生產企業在酸漿發酵方面的技術問題。

絮凝作用菌的絮凝活性高低是其能否應用到工業化生產中的重要評價指標之一[5]。因此，試驗利用平板分離法從豌豆酸漿中分離篩選出一株生長穩定且具有高絮凝淀粉活性的菌株并對其絮凝性質進行分析，從而改善淀粉生產廢液排放導致的環境污染問題，減少淀粉的生產時間和酸漿的使用量，為豌豆酸漿接種發酵提供備選菌種及純種發酵、穩定生產豌豆淀粉并研發淀粉專用微生物絮凝劑提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與培養基

新鮮豌豆（川南特產城網絡商店）；豌豆淀粉（新良新鄉網絡商店）；綠豆酸漿（微生物課題組自然發酵獲得）；細菌基因組DNA提取試劑盒（沈陽立信生物技術有限公司）；PCR引物（派森諾生物公司）；葡萄糖、大豆蛋白胨、蔗糖、酵母浸粉、H2O2（天津市科密歐化學試劑有限公司）；溶菌酶（Sigma-Aldrich公司）；胃蛋白酶（雙匯實業集團有限公司）；胰蛋白酶（南寧龐博生物工程有限公司）；纖維素酶（山東隆科特酶制劑有限公司）；糖化酶（博立生物制品有限公司）。

豌豆汁制備方法：200 g新鮮豌豆加1 L蒸餾水加熱煮沸后，轉小火煮30 min，用0.125 mm孔徑（120目）篩子加8層紗布過濾，用蒸餾水定容至1 L備用。

基礎碗豆汁培養基：20 g葡萄糖、1 g大豆蛋白胨，碗豆汁1 L，調pH至6.5，于121 ℃滅菌30 min。

改良碗豆汁培養基：30 g蔗糖、0.5 g酵母浸粉，碗豆汁1 L，調pH至6.0，于121 ℃滅菌30 min。

UV-1600紫外可見分光光度計（北京瑞利分析儀器公司）；T20MM立式高速冷凍離心機（湖南赫西儀器裝備有限公司）；ABI-2720PCR儀（美國Applied Biosystems公司）；Mini Pro 300V Power Supply電泳儀（major science USA）；ABI 3730XL測序儀（美國Applied Biosystems公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 豌豆乳的制備

稱取40 g豌豆洗凈，加入1 L自來水浸泡過夜（12~18 h），利用破壁機調節至4檔打漿10 s，使用0.125 mm孔徑（120目）篩子加8層紗布過濾后得到新鮮豌豆乳。

1.2.2 豌豆酸漿的制備

1.2.2.1 發酵豌豆酸漿的工藝

豌豆浸泡→打漿→新鮮豌豆乳→加老漿→靜置棄上清液→定容至1 L→密封培養（20~25 ℃）

1.2.2.2 酸漿的制備

新鮮豌豆乳中加入30%的綠豆發酵酸漿。棄2/3含有蛋白的上清液，用涼白開定容至1 L，置于室溫下發酵24 h。

1.2.2.3 酸漿的活化

將上述酸漿加入新制備的豌豆乳中。持續活化3個月，當酸漿pH 4~5且漿液呈青白色并有少量水沫時，結束發酵并檢測絮凝率，此時自然發酵的豌豆酸漿微生物區系趨于穩定。

1.2.3 DNA的提取與高通量測序分析

取絮凝率最高時的豌豆酸漿，分為酸漿組（SQ1，SQ2和SQ3）和沉淀淀粉組（CD1，CD2和CD3），酸漿組是指豌豆全漿中的上清液，沉淀淀粉組是指豌豆全漿中的沉淀淀粉，對2組樣品進行DNA的提取。PCR擴增正向引物為520F，反向引物為802R。將合格的序列進行文庫的擴建并上機進行高通量測序[6]。

1.2.4 ASV聚類及物種組成分析

利用Uparse軟件做ASVs聚類，代表序列為出現頻數最高的序列，利用分類數據庫在門和屬水平上統計樣品的物種組成。

1.2.5 菌株的分離與篩選

初篩。酸漿組和沉淀淀粉組分別用滅菌后的生理鹽水進行梯度稀釋，選取適宜稀釋度涂布于MRS固體培養基平板上，挑取不同形態的單個菌落進行活化，劃線接種于MRS斜面培養基上。以pH為指標，篩選出pH低于3.8的產酸菌株，對其斜面進行保存。

復篩。將產酸菌株接種至碗豆汁培養基中35 ℃培養24 h。以絮凝率為指標復篩出絮凝率大于45%的菌株。將菌株活化后再次梯度稀釋，重復劃線3次以上，直至鏡檢下菌落形態一致。

1.2.6 絮凝率（FR）測定

將5 g豌豆淀粉、100 mL蒸餾水和5 mL待測液依次加入100 mL量杯中，快速攪拌3 min后，靜置沉降3 min。在上清液面下10 mL處取樣。用紫外可見分光光度計測定其在550 nm波長處的吸光度，以空白豌豆汁培養基作對照試驗[7-8]，并用式（1）計算絮凝率。

絮凝率（FR）=（A-B）/A×100% （1）式中：A為對照組在550 nm波長處的吸光度；B為試驗組在550 nm波長處的吸光度。

1.2.7 菌種鑒定

1.2.7.1 形態特征觀察

對絮凝率最高的菌株LJ5平板上的菌落形態進行觀察并進行革蘭氏染色試驗，使用光學顯微鏡對其個體形態進行觀察。

1.2.7.2 菌種生理生化試驗

對篩選出的絮凝優勢菌LJ5進行生理生化試驗，以鑒定細菌種屬。

1.2.7.3 16S rDNA的基因序列測定以及系統發育分析

細菌基因組PCR擴增，擴增正向引物為P1（27F）和反向引物為P2（1492R）。測序結果在GenBank中進行BLAST比對，使用MEGA 10.0構建絮凝優勢菌的系統發育樹。

1.2.8 生長曲線繪制及培養時間確定

將S.harbinensisLJ5接種于改良碗豆汁培養基中，擴大培養至第3代時，間隔2 h取樣。用紫外可見分光光度計測定在600 nm波長處的吸光度，繪制生長曲線并確定最佳生長時間。采用平板計數法測定最佳生長時間的活菌數。

1.2.9 S.harbinensisLJ5絮凝性質分析

1.2.9.1 S.harbinensisLJ5絮凝活性分布

為確定S.harbinensisLJ5起絮凝作用的是菌體分泌物還是菌體細胞本身，利用光學顯微鏡和掃描電子顯微鏡觀察加入改良碗豆汁發酵液前后豌豆淀粉顆粒的分布狀態。對S.harbinensisLJ5發酵液、上清液、未洗滌菌懸液和洗滌菌懸液的絮凝率進行測定。發酵液為S.harbinensisLJ5在35 ℃培養36 h的碗豆汁發酵液；上清液為碗豆汁發酵液在10 000 r/min條件下離心10 min后的上清液；未洗滌菌懸液為碗豆汁發酵液離心后的菌體細胞加入等體積的無菌蒸餾水；洗滌菌懸液為碗豆汁發酵液離心后洗滌菌體細胞2次，再次加入等體積的無菌蒸餾水。

1.2.9.2 S.harbinensisLJ5絮凝活性的熱穩定性分析

分別測定30，40，50，60和70 ℃條件下水浴30 min后的S.harbinensisLJ5發酵液對豌豆淀粉懸濁液的絮凝率。

1.2.9.3 酶處理對S.harbinensisLJ5發酵液絮凝活性的影響

發酵液在4 ℃條件下以8 000 r/min離心20 min，收集菌體，用pH 7.0的磷酸鹽緩沖液（0.2 mol/L NaH2PO4與0.2 mol/L Na2HPO4一定比例混合）離心洗滌菌體數次，至菌體呈潔凈白色為止，收集菌體備用[9]。準確稱取1.0 g菌體，用磷酸鹽緩沖液懸浮菌體，分別加入0.3%酶質量濃度1 mg/L的溶菌酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶、纖維素酶和糖化酶，酶解pH分別為7.8，8.0，2.5，4.8和4.5，酶解溫度分別為52，37，37，50和60℃，放在200 r/min的搖床上酶解2 h[10]。以未處理的發酵液為對照組，分別測定各試驗組的絮凝率。

1.2.9.4 金屬離子對S.harbinensisLJ5發酵液絮凝活性的影響

淀粉懸濁液本身帶負電性，所以選擇陽離子進行絮凝試驗。配制1%濃度的各鹽溶液：KCl、NaCl、CaCl2和MgCl2。將發酵液與1 mL各鹽溶液一起加入100 mL的豌豆淀粉懸濁液，分別測定各試驗組的絮凝率[11]。

1.3 數據處理

利用SPSS 26.0、MEGA 10.0和Origin 2021a軟件進行數據分析和繪圖。

2 結果與分析

2.1 豌豆酸漿樣品中細菌群落的稀疏曲線

稀疏曲線可以判斷測序數量能否反映樣本中物種的組成以及測序深度和物種的豐富度程度[12-13]。隨著測序數量不斷增加，曲線呈快速上升趨勢，表明還有大量物種未被發現，而曲線平穩時表明測序深度已經飽和且基本覆蓋到樣本中所有的物種及絕大部分的微生物信息[14-15]。如圖1所示，測序數量超過20 000時，2個樣本顯示出趨于平坦的稀疏曲線，表明隨著測序深度不斷增加幾乎不會有新的物種產生，因此試驗的測序量合理[16-17]。

圖1 細菌群落稀疏曲線分析

2.2 豌豆酸漿樣品中細菌多樣性分析

由圖2可知，韋恩圖結果共得到1 088個ASVs，酸漿組中含637個ASVs，沉淀淀粉組中含451個ASVs，其中2組共有的ASVs數為88個，2組特有的ASVs分別為549和363個，表明酸漿組中微生物群落較沉淀淀粉組豐富。2組樣品多樣性指數分析見表1。酸漿組和沉淀淀粉組的細菌區系，分別獲得168 902和125 097條有效序列。Chao1指數可估計樣本群落中包含的物種總數，物種總數越多值越大[18]。因此，酸漿組中的物種總數較沉淀淀粉組的物種總數多。酸漿組的Shannon、Simpson指數顯著（P＜0.05）高于沉淀淀粉組。結果表明，酸漿組的細菌豐富度及多樣性更高。

表1 2種樣品中細菌Alpha多樣性指數

圖2 2種樣品的ASVs聚類

2.3 豌豆酸漿樣品中細菌群落結構差異分析

2.3.1 門水平下豌豆酸漿樣品中細菌群落結構分析

由圖3可知，在門水平下，酸漿組與沉淀淀粉組共鑒定出8個門類細菌。酸漿組中變形菌門（Pro-teobacteria）、厚壁菌門（Firmicutes）、擬桿菌門（Bacteroidetes）和放線菌門（Actinobacteria），所占比例依次為56.92%，38.35%，3.80%和0.91%；沉淀淀粉組中厚壁菌門（Firmicutes）、放線菌門（Actinobacteria）、變形菌門（Proteobacteria）和藍藻菌門（Cyanobacteria），所占比例依次為55.84%，41.03%，1.76%和0.98%。酸漿組中的優勢菌門為變形菌門，沉淀淀粉組中的優勢菌門為厚壁菌門。

圖3 基于門水平的細菌結構

2.3.2 屬水平下豌豆酸漿樣品中細菌群落結構分析

由圖4可知，在屬水平下，酸漿組與沉淀淀粉組的細菌隸屬于8個屬，酸漿組中醋酸桿菌屬（Acetobacter）、乳酸桿菌屬（Lactobacillus）和乳球菌屬（Lactococcus）所占比例依次為55.70%，25.12%和10.13%；沉淀淀粉組中乳酸桿菌屬（Lactobacillus）、雙歧桿菌屬（Bifidobacterium）和醋酸桿菌屬（Acetobacter）所占比例依次為55.60%，41.03%和1.52%。酸漿組中的優勢菌屬為醋酸桿菌屬，沉淀淀粉組中的優勢菌屬為乳酸桿菌屬。

圖4 基于屬水平的細菌結構

2.4 菌株的分離與篩選

以pH為指標從自然發酵豌豆酸漿樣品中初篩共分離出36株pH低于3.8的菌株，以絮凝率為指標復篩出6株絮凝率大于45%的菌株，結果見表2。選擇絮凝率最高達71.2%±2.0%的菌株LJ5作為后續試驗的研究對象。

表2 由豌豆酸漿分離出的6株菌對淀粉的絮凝率

2.5 菌種鑒定

對絮凝活性較高的菌株LJ5進行菌種鑒定。菌株LJ5的菌落形態見圖5（A），光學顯微鏡下形態見圖5（B）。

圖5 菌株LJ5菌落形態及其革蘭氏染色菌體形態

2.5.1 形態特征觀察

通過光學顯微鏡觀察絮凝優勢菌LJ5在MRS培養基中的形態和菌落特征。菌株LJ5的菌體大小為0.5 μm×2.5 μm，桿狀，鏈狀排布方式、革蘭氏陽性、無芽孢、不運動。菌株LJ5的菌落大小為1~3 mm，菌落形態為灰白色圓形、不透明、低凸隆起有光澤、邊緣不整齊、表面不光滑。

2.5.2 生理生化試驗

試驗結果見表3，初步判斷絮凝優勢菌LJ5為乳酸桿菌屬。

表3 菌株LJ5生理生化試驗結果

2.5.3 16 S rDNA序列分析結果及系統發育樹的構建

6株絮凝菌純化后的16S rDNA的PCR產物瓊脂糖凝膠電泳結果如圖6所示。使用測序儀ABI 3730XL進行DNA測序。用NCBI中的BLAST程序將拼接后的序列文件與NCBI中16S rDNA數據庫中的數據進行比對，選擇相似度最大的序列作為物種鑒定的結果[19]。

圖6 菌株LJ5的16S rDNA電泳圖譜

經16S rDNA鑒定，菌株LJ5的16S rDNA序列全長為1 451 bp，經GenBank比對，與Schleiferilactobacillus harbinensis相似性達到100%。利用MEGA 10.0軟件構建系統發育樹，菌株LJ5與Schleiferilactobacillus harbinensisOK271739.1親緣關系最近，結果如圖7所示。結合其群體、個體形態特征、生理生化試驗及16S rDNA序列比對，確定菌株LJ5為哈爾濱施萊弗乳桿菌，命名為Schleiferilactobacillus harbinensisLJ5。

圖7 菌株LJ5基因序列系統發育樹

2.6 生長曲線的測定

生長曲線如圖8所示。接種0~4 h為延滯期，4~24 h為對數生長期，24~58 h為穩定期，之后為衰亡期。結合S.harbinensisLJ5實際用途是用于豌豆酸漿的純種發酵，為獲得高絮凝淀粉活性的豌豆酸漿，對于菌株種子液的活菌數和活力均要求較高，所以選擇對數期末期、穩定期前期為發酵終點，最佳發酵時間為24 h。發酵24 h時菌液的活菌數為8.31±0.03 lg CFU/mL。

圖8 S.harbinensis LJ5生長曲線

2.7 S.harbinensis LJ5絮凝性質分析

2.7.1 S.harbinensisLJ5絮凝活性物質分布

普遍認為微生物絮凝劑分為兩類：一類微生物分泌的胞外產物具有絮凝作用，如發酵乳桿菌的分泌物，其胞外產物具有絮凝作用，而菌體本身沒有絮凝作用[20]；另一類是菌體本身具有絮凝作用，如副干酪乳桿菌副干酪亞種[21]。光學顯微鏡下觀察到加入發酵液前后豌豆淀粉顆粒的分布狀態如圖9（A和B）所示。加入發酵液前，淀粉顆粒在顯微鏡下均勻分布，加入發酵液后，眾多淀粉顆粒凝聚成大的絮凝體。如圖9（C和D）所示，通過掃描電子顯微鏡可以觀察到加入發酵液前后淀粉顆粒的變化，菌粘附在淀粉顆粒表面并且使淀粉顆粒粘結在一起，所以在絮凝淀粉過程中使淀粉顆粒凝集成大的絮凝體，正是淀粉顆粒粘結體積變大后重力的增加，從而加速淀粉的沉降。發酵液絮凝位置分析圖如圖9（E）所示。絮凝率大小順序為發酵液＞未洗滌菌懸液＞洗滌菌懸液＞上清液。其中，未洗滌菌懸液和洗滌菌懸液與發酵液的絮凝率差異較小，都具有很強的絮凝活性，可能是由于離心分離過程損失一部分的菌體細胞，使菌體細胞數量減少，導致絮凝活性的稍有下降。而上清液與發酵液的絮凝率差異較大，去細胞后的上清液基本不具有絮凝活性，表明S.harbinensisLJ5的絮凝活性物質主要存在于菌體細胞本身，而不是分泌到胞外的代謝產物。結合光學顯微鏡和電子顯微鏡下S.harbinensisLJ5粘附淀粉顆粒的特性與絮凝活性物質存在于菌體細胞本身，表明絮凝因子可能在菌體細胞的表面。

圖9 豌豆淀粉顆粒分布及絮凝位置分析圖

2.7.2 S.harbinensisLJ5絮凝活性的熱穩定性分析

從圖10可以看出，溫度對S.harbinensisLJ5的絮凝活性影響很大，在30~40 ℃范圍內，發酵液的絮凝活性從71.5%降至68.5%，而溫度大于50 ℃時，發酵液基本不具有絮凝活性，表明S.harbinensisLJ5發酵液的絮凝因子不具有熱穩定性，對溫度較為敏感。

圖10 發酵液絮凝活性的熱穩定性分析圖

2.7.3 酶處理對S.harbinensisLJ5發酵液絮凝活性的影響

由圖11可知，空白組的絮凝率最高，為71.1%。溶菌酶、胰蛋白酶與胃蛋白酶3種酶對發酵液的絮凝活性都有不同程度的抑制作用，其中胰蛋白酶和胃蛋白酶的抑制作用較大，而用纖維素酶和糖化酶作用后的絮凝率基本沒有變化，表明S.harbinensisLJ5絮凝因子可能是蛋白類物質。結合上述試驗結果推測絮凝因子可能為菌體細胞表面的蛋白類物質。

圖11 酶處理對發酵液絮凝活性的影響

2.7.4 金屬離子對S.harbinensisLJ5發酵液絮凝活性的影響

膠體理論表明陽離子可以和帶負電性膠體微粒的表面電荷結合，從而克服靜電排斥力使膠體顆粒脫穩形成細小的凝聚體并與微生物絮凝劑反應形成大絮凝團快速下沉。不同金屬陽離子對發酵液絮凝活性的影響如圖12所示。Na+、K+對發酵液的絮凝活性均有增強作用，Ca2+、Mg2+對絮凝活性也有不同程度的促進作用。其中，Na+的促進作用最強，所以可選Na+作為助凝劑。

圖12 金屬離子對發酵液絮凝活性的影響

3 結論

通過高通量測序技術分析酸漿組和沉淀淀粉組中的微生物多樣性，從中分離篩選出一株在碗豆汁培養基中生長穩定且具有高絮凝淀粉活性的S.harbinensisLJ5，為豌豆酸漿接種發酵提供備選菌種。通過絮凝活性位置分析確定絮凝活性物質主要存在于菌體細胞本身。菌株發酵液的絮凝活性受溫度影響顯著，絮凝活性在30 ℃時最高，而溫度在50 ℃以上時，發酵液就基本不具有絮凝活性，絮凝因子對溫度比較敏感。胰蛋白酶和胃蛋白酶對發酵液的抑制作用較強，說明絮凝活性物質可能是蛋白類的物質。Na+對發酵液的絮凝活性促進作用最強，可選Na+作為助凝劑。