響應(yīng)面法優(yōu)化牛蒡根多酚的閃式提取工藝

張朋，丁朋，丁利，耿影，付婷偉 ，寧曉雅

1.徐州天益食品科技研究院有限公司（徐州 210009）；2.徐州工程學(xué)院食品（生物）工程學(xué)院（徐州 221111）；3.江蘇省食品資源開(kāi)發(fā)與質(zhì)量安全重點(diǎn)建設(shè)實(shí)驗(yàn)室，徐州工程學(xué)院（徐州 221111）

多酚類(lèi)物質(zhì)是植物的重要代謝產(chǎn)物，廣泛存在于果蔬、谷物、豆類(lèi)等植物組織中[1]。就植物自身而言，多酚類(lèi)物質(zhì)對(duì)其生長(zhǎng)和繁殖會(huì)起到不可替代的作用[2]?，F(xiàn)代研究表明，多酚類(lèi)物質(zhì)具有顯著的自由基清除、防衰抗老、防輻射、抗癌、降糖、抑制脂質(zhì)過(guò)氧化、防治心腦血管疾病等多重生理功效[3-6]。此外，多酚類(lèi)物質(zhì)作為天然的功能因子還可在食品加工過(guò)程中輔助形成特定食品的苦澀味、顏色、香氣，是食品感官及營(yíng)養(yǎng)質(zhì)量的重要決定因素[7]。因此，植物源多酚類(lèi)物質(zhì)具有巨大的開(kāi)發(fā)潛力和應(yīng)用潛力。

牛蒡根是我國(guó)傳統(tǒng)的具有較高藥用價(jià)值和保健價(jià)值的藥食用蔬菜[8]。牛蒡根富含膳食纖維、蛋白質(zhì)、氨基酸、維生素、菊糖、牛蒡苷、多酚等成分[9-10]，具有提高機(jī)體免疫，防治糖尿病、性機(jī)能減退、便秘等功效，在治療風(fēng)濕、中風(fēng)等方面效果明顯[11-12]。牛蒡多酚是牛蒡的重要活性物質(zhì)，現(xiàn)代研究顯示牛蒡多酚作為牛蒡生物保健功能物質(zhì)的地位[13]。因此開(kāi)展牛蒡多酚類(lèi)物質(zhì)的檢測(cè)、提取、分離純化、功能驗(yàn)證等方面的系列研究對(duì)于牛蒡產(chǎn)業(yè)的發(fā)展具有現(xiàn)實(shí)意義。采用響應(yīng)面法優(yōu)化牛蒡根多酚閃式提取工藝條件，并探討其體外抗氧化活性，為拓展牛蒡精深加工路徑、實(shí)現(xiàn)牛蒡功能因子產(chǎn)業(yè)化提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮帶皮牛蒡干燥切片[天益食品（徐州）有限公司]；苯酚（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；30%過(guò)氧化氫（H2O2，Aladdin公司）；蘆丁、沒(méi)食子酸、福林酚（上海葉源生物科技有限公司）；其余試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

閃式提取器ZBEH-50T（河南智晶生物科技發(fā)展有限公司）；L-550高速離心機(jī)（長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司）；TU-1810紫外分光光度計(jì)（北京普析通用有限公司）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 牛蒡根預(yù)處理

使用粉碎機(jī)將牛蒡根干切片粉碎后過(guò)0.250 mm（60目）篩，牛蒡粉裝于自封袋中于干燥器中保存，備用。

1.3.2 多酚含量的測(cè)定

1.3.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

準(zhǔn)確稱(chēng)取0.010 0 g沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)品于燒杯中，用蒸餾水溶解后轉(zhuǎn)入100 mL容量瓶中定容，得質(zhì)量濃度為0.10 mg/mL的沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液。分別量取0，0.25，0.50，0.75，1.00，1.25和1.50 mL 0.10 mg/mL沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液于25 mL棕色容量瓶，加入10 mL蒸餾水，再加入1 mL福林酚，搖勻后加入10 mL 7%的Na2CO3溶液，搖勻后定容至25 mL，即得質(zhì)量濃度分別為0，0.01，0.02，0.03，0.04，0.05和0.06 mg/mL的沒(méi)食子酸溶液，于常溫避光放置30 min，在波長(zhǎng)765 nm處測(cè)定吸光度，以沒(méi)食子酸溶液濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.2.2 多酚得率的計(jì)算（式1）

式中：C為多酚提取液質(zhì)量濃度，mg/mL；N為稀釋倍數(shù)；V為提取液體積，mL；M為牛蒡質(zhì)量，mg。

1.3.3 牛蒡根中多酚的提取

1.3.3.1 提取溫度對(duì)牛蒡多酚得率的影響

取適量牛蒡粉，按料液比1︰40 g/mL加入體積分?jǐn)?shù)70%的乙醇，在提取電壓100 V條件下，分別在50，60，70，80和90 ℃條件下用閃式提取器提取60 s，得到的提取液在4 000 r/min條件下離心15 min，使用1.3.2小節(jié)的方法計(jì)算多酚得率。

1.3.3.2 料液比對(duì)牛蒡多酚得率的影響

取適量牛蒡粉，分別按料液比1︰10，1︰20，1︰30，1︰40和1︰50 g/mL加入體積分?jǐn)?shù)70%的乙醇，在提取電壓100 V、提取溫度70 ℃條件下，用閃式提取器提取60 s，得到的提取液在4 000 r/min條件下離心15 min，使用1.3.2小節(jié)的方法計(jì)算多酚得率。

1.3.3.3 提取時(shí)間對(duì)牛蒡多酚得率的影響

取適量牛蒡粉，按料液比1︰40 g/mL加入體積分?jǐn)?shù)70%的乙醇，在提取電壓100 V、提取溫度70 ℃條件下，用閃式提取器分別提取50，60，70，80和90 s，得到的提取液在4 000 r/min 條件下離心15 min，使用1.3.2小節(jié)的方法計(jì)算多酚得率。

1.3.3.4 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及響應(yīng)面分析

在單因素試驗(yàn)結(jié)果基礎(chǔ)上，采用Box-Behnken設(shè)計(jì)方案，以提取溫度（A）、料液比（B）、提取時(shí)間（C）為考察因素，以牛蒡多酚得率為響應(yīng)值，使用Design-Expert 8.06軟件優(yōu)化多酚提取工藝參數(shù)。因素水平見(jiàn)表1。

表1 試驗(yàn)因素及水平

2 結(jié)果與分析

2.1 多酚標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

采用1.3.2.1的方法繪制多酚標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖1所示。

圖1 沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線

標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為y=9.607 1x+0.105 4，相關(guān)系數(shù)R2=0.999，在沒(méi)食子酸質(zhì)量濃度0~0.07 mg/mL范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好。

2.2 單因素對(duì)牛蒡多酚提取的影響

2.2.1 提取溫度對(duì)牛蒡多酚提取的影響

在不同的提取溫度下，牛蒡多酚的得率不同?？疾觳煌崛囟葘?duì)牛蒡多酚提取的影響，結(jié)果如圖2所示。

圖2 提取溫度對(duì)牛蒡多酚得率的影響

結(jié)果表明，牛蒡多酚得率隨著提取溫度的升高而提高。提取溫度80 ℃時(shí)，提取率達(dá)0.72%±0.04%，提取溫度升高至90 ℃時(shí)，多酚提取率為0.75%±0.05%。2種溫度條件下，多酚得率間未表現(xiàn)顯著差異，因此確定牛蒡多酚的提取溫度選擇80 ℃。

2.2.2 料液比對(duì)牛蒡多酚提取的影響

采用1.3.3.2的方法探討料液比對(duì)牛蒡多酚提取的影響。具體的結(jié)果如圖3所示。

圖3 料液比對(duì)牛蒡多酚得率的影響

結(jié)果表明，不同料液比會(huì)對(duì)多酚得率產(chǎn)生較明顯影響。料液比1︰30 g/mL時(shí)，多酚得率達(dá)到0.57%，隨著料液比繼續(xù)增大，多酚得率反而驟然下降，說(shuō)明料液比1︰30 g/mL可有效溶出牛蒡根中的多酚物質(zhì)，因此選擇1︰30 g/mL作為牛蒡多酚提取的最優(yōu)料液比。

2.2.3 提取時(shí)間對(duì)牛蒡多酚提取的影響

提取時(shí)間對(duì)牛蒡多酚提取的影響結(jié)果如圖4所示。

圖4 提取時(shí)間對(duì)牛蒡多酚得率的影響

結(jié)果顯示，提取時(shí)間70 s內(nèi)多酚得率隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)而顯著升高，提取時(shí)間70~90 s內(nèi)，多酚得率趨于平緩，數(shù)值上未有顯著變化。因此確定70 s為牛蒡多酚閃式提取的最佳提取時(shí)間。

2.3 響應(yīng)面法優(yōu)化牛蒡多酚提取工藝

2.3.1 回歸模型的建立及顯著性檢驗(yàn)

以牛蒡多酚得率為響應(yīng)值，采用Box-Behnken設(shè)計(jì)方案優(yōu)化牛蒡根中多酚的提取工藝。試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表2，方差分析結(jié)果見(jiàn)表3。利用Design Expert 8.06軟件對(duì)表2中數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，得到響應(yīng)值對(duì)自變量的回歸方程：Y=0.75+0.082A-0.028B-0.047C+0.034AB-0.036AC+0.031BC-0.054A2-0.049B2-0.072C2。

表2 Box-Behnken響應(yīng)面設(shè)計(jì)及其結(jié)果

表3 方差分析表

由方差分析結(jié)果可知，該回歸模型極顯著（P＜0.01），失擬項(xiàng)（P=0.152 3）不顯著，表明試驗(yàn)值與預(yù)測(cè)值顯著相關(guān)（R2=0.986 3，Radj2=0.960 1），模型與試驗(yàn)擬合良好，該模型可以反映牛蒡多酚得率的預(yù)測(cè)及分析。由表3還可以發(fā)現(xiàn)自變量對(duì)響應(yīng)值即多酚得率的影響程度，其影響大小排序依次為提取溫度（A）＞提取時(shí)間（C）＞料液比（B），其中因素A對(duì)多酚得率影響極顯著（P＜0.01），因素B、C和AC的交互作用對(duì)多酚得率的影響顯著（P＜0.05）。

2.3.2 牛蒡多酚提取響應(yīng)面分析與優(yōu)化

兩兩因素間的交互作用對(duì)牛蒡多酚得率的影響如圖5所示。圖中曲面越陡，變量對(duì)多酚得率影響就會(huì)越大。影響因素提取溫度和提取時(shí)間的交互作用顯著影響牛蒡多酚得率（P＜0.05），而提取溫度與料液比、提取時(shí)間與料液比間的交互作用對(duì)得率的影響不顯著（P＞0.05）。使用軟件分析，牛蒡多酚的最優(yōu)提取參數(shù)為提取溫度83.70 ℃、料液比1∶30.15 g/mL、提取時(shí)間67.78 min，此條件下牛蒡多酚得率為0.777 8%。經(jīng)全面綜合考慮，修正提取參數(shù)：提取溫度84 ℃、料液比1∶30 g/mL、提取時(shí)間68 min。經(jīng)驗(yàn)證，此條件下多酚得率為0.779 3%。預(yù)測(cè)值與實(shí)際值間的相對(duì)偏差為-0.001 5，說(shuō)明可以使用該模型預(yù)測(cè)牛蒡多酚的提取情況。

圖5 兩兩因素交互作用對(duì)牛蒡多酚提取影響的響應(yīng)面圖

3 結(jié)論

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，以多酚得率為指標(biāo)，采用響應(yīng)面分析法優(yōu)化牛蒡多酚閃式提取工藝。使用該方法建立的牛蒡多酚提取得率的預(yù)測(cè)模型為Y=0.75+0.082A-0.028B-0.047C+0.034AB-0.036AC+0.031BC-0.054A2-0.049B2-0.072C2。最優(yōu)提取條件為提取溫度84 ℃、料液比1∶30 g/mL、提取時(shí)間68 min。在該條件下牛蒡多酚得率達(dá)0.779 3%。試驗(yàn)對(duì)牛蒡多酚閃式提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，獲得的預(yù)測(cè)模型可有效預(yù)測(cè)牛蒡多酚的提取情況。閃式提取工藝的使用不僅可以避免傳統(tǒng)提取方法可能帶來(lái)的有效成分被破壞的弊端，還可有效提高活性成分的提取效率、縮短提取時(shí)間、減少提取溶劑使用量等，是活性成分提取的有效方法。牛蒡多酚閃式提取工藝的優(yōu)化有助于開(kāi)拓牛蒡產(chǎn)業(yè)發(fā)展路徑，挖掘牛蒡資源的開(kāi)發(fā)應(yīng)用潛力，同時(shí)為天然功能因子的產(chǎn)業(yè)化提供思路與參考。