阿克蘇野生牛肝菌多糖提取優(yōu)化及不同組分抗氧化活性分析

馮 倩,何 齊,李 雪,易鴛鴦,孫 建,朱 靜,顧美英,譚慧林,張志東,

0 引 言

【研究意義】新疆阿克蘇地區(qū)位于天山南麓,楊樹資源豐富,每年的7～9月大量牛肝菌子實(shí)體成熟,有關(guān)該地區(qū)野生牛肝菌相關(guān)研究報(bào)道較少。多糖是牛肝菌中的主要次生代謝產(chǎn)物之一,加大對(duì)相關(guān)牛肝菌多糖的提取和功能評(píng)價(jià),對(duì)于進(jìn)一步開發(fā)和利用阿克蘇地區(qū)野生牛肝菌資源具有重要意義。【前人研究進(jìn)展】蘑菇多糖提取一般采用水提醇沉,其中,隨著乙醇濃度的增加,不同組分多糖的相對(duì)分子質(zhì)量降低,抗氧化活性增強(qiáng)[1]。同時(shí),乙醇分級(jí)沉淀可使分子量大小有差別的多糖在濃度不同的乙醇中析出,獲得不同組分多糖,表現(xiàn)出不同活性[2]。【本研究切入點(diǎn)】目前,有關(guān)阿克蘇野生牛肝菌鮮有報(bào)道,為皺皮疣柄牛肝菌(Leccinumduriusculum)[3],其多糖的提取和理化特性、抗氧化活性等尚無報(bào)道。需研究野生牛肝菌多糖提取優(yōu)化及不同組分抗氧化活性分析。【擬解決的關(guān)鍵問題】采用熱水提取法,優(yōu)化牛肝菌粗多糖最佳工藝條件,研究不同醇沉多糖組分的水溶性、持水力、粘度及體外抗氧化活性,為野生牛肝菌的進(jìn)一步開發(fā)利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

野生牛肝菌,采自阿克蘇市拜城縣賽里木鎮(zhèn)(E 82°11′55",N 41°47′10")。新鮮牛肝菌子實(shí)體經(jīng)清洗干凈后切片,80℃烘干6 h,粉碎,過60目篩,備用。 圖1

圖1 阿克蘇楊樹林下野生牛肝菌

1.2 方 法

1.2.1 粗多糖提取的初始條件

稱取一定量的牛肝菌子實(shí)體粉末,以水為提取液,按料液比1∶ 20,80℃下提取2 h后,8 000 r/min,離心5 min,收集上清液,加入無水乙醇至終濃度為80%,于4℃靜置過夜,以6 000 r/min,離心5 min,收集沉淀,并將沉淀用80%乙醇洗滌兩次;于-80℃冷凍干燥,得到牛肝菌粗多糖。

多糖提取率(%)=(多糖質(zhì)量/菌粉質(zhì)量)×100%。

(1)

1.2.2 多糖含量測(cè)定

多糖含量測(cè)定采用“苯酚-硫酸法”[4],以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)品制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.3 牛肝菌粗多糖提取的工藝優(yōu)化

1.2.3.1 單因素試驗(yàn)

選取料液比、浸提溫度和浸提時(shí)間為因素,分別分析不同料液比(1∶ 20、1∶ 25、1∶ 30、1∶ 35、1∶ 40 g/mL)、不同浸提溫度(50、60、70、80、90℃)和不同浸提時(shí)間(1、2、3、4、5 h)對(duì)野生牛肝菌總多糖提取率的影響。在每個(gè)因素不同處理中,除了考察的單因素?cái)?shù)值變動(dòng)外,其他考察因素取固定值。

1.2.3.2 正交試驗(yàn)

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,選取料液比(A)、提取溫度(B)和提取時(shí)間(C)3個(gè)因素,設(shè)置L9(33)正交試驗(yàn),優(yōu)化提取工藝。表1

表1 牛肝菌粗多糖提取條件優(yōu)化正交試驗(yàn)因素與水平

1.2.4 牛肝菌不同組分多糖的制備

取一定量的粗多糖,充分溶解于水中,配制成一定濃度的多糖溶液,加入無水乙醇使體系終濃度達(dá)到40%,于 4℃ 醇沉過夜,6 000 r/min離心5 min,收集下層沉淀,獲得LD-40多糖。向處理后的上清液中繼續(xù)添加無水乙醇,使體系終濃度為80%,于4℃冰箱醇沉過夜,6 000 r/min 離心5 min,收集下層沉淀,獲得LD-80多糖。將獲得的LD-40和LD-80冷凍干燥,備用,計(jì)算各多糖組分提取率。

1.2.5 多糖水合特性的測(cè)定

1.2.5.1 水溶性

參照文獻(xiàn)方法[5],準(zhǔn)確稱取0.2 g不同組分粗多糖樣品,置于50 mL的燒杯中,再加入20 mL的去離子水, 90℃連續(xù)攪拌水浴30 min,水浴結(jié)束后,6 000 r/min,離心10 min,取上清液,于105℃烘干至恒重,記錄質(zhì)量,計(jì)算多糖的水溶性。

(2)

式中,M0表示烘干后固體的質(zhì)量,M表示樣品質(zhì)量。

1.2.5.2 持水力(WHC)測(cè)定

參照文獻(xiàn)方法[6]略做修改,準(zhǔn)確稱取0.2 g不同組分多糖樣品,于50 mL的離心管中,加入40 mL的蒸餾水,振蕩搖勻后室溫靜置24 h,轉(zhuǎn)速為6 000 r/min條件下離心10 min,去除上清液,并使用濾紙吸取沉淀中的剩余水分,然后稱量沉淀重量并作記錄。

(3)

式中,M1表示樣品恒重后的質(zhì)量,M表示樣品質(zhì)量。

1.2.5.3 粘度測(cè)定

分別配制濃度為5、10、20 mg/mL的2種多糖組分溶液各30 mL,置于燒杯中,使用SNB-2數(shù)字式粘度計(jì)測(cè)定,采用3號(hào)轉(zhuǎn)子,轉(zhuǎn)速為12 r/min,室溫測(cè)定,記錄數(shù)據(jù)。

1.2.6 不同多糖組分的抗氧化試驗(yàn)

1.2.6.1 DPPH 自由基清除率測(cè)定

參照文獻(xiàn)方法[7]略作修改,以水溶性VC作陽(yáng)性對(duì)照,蒸餾水作空白對(duì)照。加不同濃度的多糖溶液,再加0.1 mmol/L 的DPPH溶液,渦旋混勻。避光反應(yīng)0.5 h,5 000 r/min,離心5 min,用酶標(biāo)儀于517 nm處測(cè)定吸光度值。以上步驟3個(gè)平行,取均值。

(4)

式中,A0表示空白對(duì)照的吸光度值;A1表示樣品的吸光度值。

1.2.6.2 羥自由基清除率測(cè)定

參考文獻(xiàn)[8]方法略作修改,以水溶性VC作陽(yáng)性對(duì)照,蒸餾水作空白對(duì)照。加入不同濃度的多糖溶液, 9 mmol/L FeSO4,9 mmol/L水楊酸無水乙醇,8.8 mmol/L H2O2,渦旋混勻,37℃反應(yīng)0.5 h,5 000 r/min,離心5 min,用酶標(biāo)儀測(cè)定510 nm處吸光度值,以上步驟3個(gè)平行,取均值。

(5)

式中,A0表示空白對(duì)照的吸光度值;A1表示樣品的吸光度值;A2表示蒸餾水替代H2O2的吸光值。

1.2.6.3 還原能力測(cè)定

參考文獻(xiàn)[9]方法,配制不同濃度多糖溶液,將0.2 mol/L PBS(pH=6.6)和多糖溶液混勻,再加入1%(W/V)的鐵氰化鉀溶液,渦旋混勻后50℃水浴保溫30 min,流水冷卻后加入10%(W/V)的三氯乙酸,混勻后10 000 r/min,離心5 min,取上清液,加入蒸餾水和0.1%的氯化鐵,靜置10 min,700 nm比色,記錄其吸光度值。

1.3 數(shù)據(jù)處理

使用Excel2019整理數(shù)據(jù), 用SPSS.25對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 多糖測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

研究表明,以葡萄糖含量為橫坐標(biāo)、吸光度值(A)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得出線性回歸方程為y=7.256 5x-0.005 3,R2=0.999 1,標(biāo)準(zhǔn)曲線呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。圖2

圖2 多糖測(cè)定工作曲線

2.2 牛肝菌粗多糖提取工藝單因素

2.2.1 提取溫度對(duì)多糖得率的影響

研究表明,在提取時(shí)間為2 h,料液比為1∶ 20的條件下,多糖得率與提取溫度之間存在正相關(guān)關(guān)系,即隨著溫度的增加多糖的提取率也增加,其中80℃時(shí)多糖得率為9.9%,90℃時(shí)得率最高,達(dá)到 10.72%,僅較80℃時(shí)多糖得率高出0.82%,后續(xù)試驗(yàn)選取80℃。圖3

圖3 不同提取溫度下多糖得率變化

2.2.2 提取料液比對(duì)多糖得率的影響

研究表明,在浸提時(shí)間為 2 h、提取溫度為80℃的條件下,料液比1∶ 20～1∶ 30,多糖得率明顯上升,到1∶ 30時(shí)到達(dá)頂峰,水量增多有助于多糖的擴(kuò)散傳質(zhì),當(dāng)料液比超過1∶ 30后,多糖得率反而下降。選取1∶ 25為較好料液比。圖4

圖4 不同料液比下多糖得率變化

2.2.3 提取時(shí)間對(duì)多糖得率的影響

研究表明,在料液比為1∶ 25,提取溫度為80℃的條件下,隨著浸提時(shí)間的增加而增加,但上升速率較慢,在1 h時(shí)多糖得率為10.00%,繼續(xù)延長(zhǎng)提取時(shí)間到4 h時(shí)得率最高為11.54%,再增加提取時(shí)間對(duì)多糖的提取率基本不變,而提取時(shí)間的延長(zhǎng)也會(huì)導(dǎo)致能源消耗增加,以提取時(shí)間2、3、4 h作為正交試驗(yàn)中的試驗(yàn)參數(shù)。圖5

圖5 不同提取時(shí)間下多糖得率變化

2.3 牛肝菌多糖提取的正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)

研究表明,對(duì)多糖提取率的影響較大的因素是提取時(shí)間,其次是提取溫度,料液比對(duì)多糖提取率的影響最小。 A2B1C2,即料液比1∶ 25,溫度75℃,時(shí)間3 h,多糖得率最高可達(dá)到12.92%。最佳提取條件為A3B2C2,即料液比1∶ 30,溫度80℃,時(shí)間3 h。多糖得率最高為13.36%。表2

表2 牛肝菌粗多糖提取正交試驗(yàn)

2.4 不同多糖組分水溶性和持水力

研究表明,采用終濃度40%無水乙醇,獲得LD-40多糖。繼續(xù)添加無水乙醇,使體系終濃度為80%,獲得LD-80多糖。通過干燥后計(jì)算,LD-40和 LD-80的占野生牛肝菌多糖的92.37%、7.63%。

LD-40持水力大于LD-80,而LD-80的水溶性強(qiáng)于LD-40,小分子多糖較大分子多糖易溶解。 表3

表3 不同多糖組分的水合性質(zhì)

2.5 不同多糖組分的粘度

研究表明,兩種多糖組分的粘度均隨著多糖濃度的升高而高,且在相同濃度下,LD-40粘度明顯強(qiáng)于LD-80,當(dāng)多糖濃度達(dá)到20 mg/mL時(shí),LD-40粘度最大為1 059 mPa.s,而LD-80粘度僅為573.6 mPa·s,LD-40粘度約為L(zhǎng)D-80的2倍。圖6

圖6 不同濃度下各多糖組分粘度變化

2.6 體外抗氧化試驗(yàn)

2.6.1 DPPH 自由基清除試驗(yàn)

研究表明,當(dāng)有清除自由基的物質(zhì)存在時(shí),溶液會(huì)從最初的紫色變?yōu)榉€(wěn)定的黃色,其褪色程度與抗氧化能力成正相關(guān)。兩種多糖隨著質(zhì)量濃度的升高而上升,相同濃度下LD-80對(duì) DPPH 自由基的清除能力明顯高于LD-40,在多糖濃度為10 mg/mL時(shí),LD-80對(duì)DPPH 的清除作用最高達(dá)到 48%。圖7

圖7 不同濃度下各多糖組分對(duì)

2.6.2 羥基自由基清除試驗(yàn)

研究表明,在 1.25～10 mg/mL 范圍內(nèi),LD-40和 LD-80兩種組分對(duì)羥自由基的清除能力都隨著質(zhì)量濃度的升高而上升,相同濃度下LD-80對(duì)羥基自由基的清除作用強(qiáng)于LD-40,但遠(yuǎn)低于同等濃度下VC的清除能力。圖 8

圖8 不同濃度下各多糖組分對(duì)

2.6.3 還原能力試驗(yàn)

研究表明,與清除 DPPH自由基和清除羥基自由基能力相似,在 1.25～10 mg/mL 的質(zhì)量濃度范圍,2種多糖組分的還原能力均隨著質(zhì)量濃度的升高而上升,當(dāng)濃度達(dá)到8 mg/mL以后兩者增長(zhǎng)均不明顯。最高濃度10 mg/mL時(shí),LD-80吸光度值最高可達(dá)1.02,而LD-40僅為0.27,盡管LD-80還原能力明顯強(qiáng)于LD-40,但其遠(yuǎn)低于同等濃度下VC的還原能力。圖9

圖9 不同濃度各多糖組分的還原能力

3 討 論

DPPH 自由基是一種極為穩(wěn)定的自由基,在它接受氫自由基或電子后,會(huì)變成穩(wěn)定的基團(tuán)分子[10]。一般還原能力越強(qiáng),其抗氧化能力越強(qiáng)[11,12]。蘑菇多糖普遍具有抗氧化[13]、降血糖[14]、免疫調(diào)節(jié)[15]、保肝[16]等多種生物活性。目前,熱水提取法是多糖提取中應(yīng)用最為廣泛也是操作最為簡(jiǎn)單的一種方法,具有設(shè)備簡(jiǎn)單,易于操作,成本低廉的特點(diǎn)[17],且不會(huì)對(duì)天然活性物質(zhì)多糖的結(jié)構(gòu)及活性產(chǎn)生過多影響,有利于后續(xù)試驗(yàn)的進(jìn)行[18]。試驗(yàn)通過水提法提取野生牛肝菌多糖,優(yōu)化了提取工藝,使多糖得率達(dá)到13.36%,顯著比杜敏華等[19]提取的野生牛肝菌多糖得率高出了4.23%,阿克蘇野生牛肝菌更富含多糖。

研究獲得了LD-40和LD-80,分別占粗多糖的92.3%、7.63%,野生牛肝菌可用較低濃度乙醇就可以獲得絕大部分多糖 。在相同濃度下,LD-40粘度和持水力均強(qiáng)于LD-80,原因可能是與多糖的分子量有關(guān),乙醇體積分?jǐn)?shù)越高,多糖分子量越小[20]。LD-40為大分子多糖,其粘度也較高的現(xiàn)象;但LD-80為小分子多糖,易溶解,所以水溶性較高。多糖的持水性等物理性質(zhì)常作為評(píng)價(jià)食品加工過程中物質(zhì)的口感、質(zhì)地和風(fēng)味的重要指標(biāo),高粘度的多糖可作為增稠劑或膠凝劑,用于調(diào)整食品的流動(dòng)性、可塑性和口感。酸奶中添加多糖會(huì)增加酸奶粘稠度,并且多糖的生物功能與其理化組成、水溶性、粘度等緊密相關(guān)[23]。在食品加工時(shí)可優(yōu)先選擇LD-40組分作為增稠劑。

不同菌蘑多糖其抗氧化功能存在明顯的差異,如紅托竹蓀菌托多糖的抗氧化能力最佳,香菇多糖次之,黑木耳多糖最差[24]。長(zhǎng)白山野生牛肝菌的抗氧化能力也較強(qiáng),多糖濃度在0.8 mg/mL下清除羥基自由基能力達(dá)到96.82%[25]。研究中不同組分多糖抗氧化活性具有明顯差異,LD-80體外抗氧化能力優(yōu)于LD-40,但當(dāng)LD-80濃度達(dá)到10 mg/mL 時(shí),其清除DPPH和OH-自由基能力也僅達(dá)到48% 和 52% ,遠(yuǎn)低于一般菌多糖抗氧化能力,與報(bào)道的皺蓋疣柄牛肝菌多糖[7]抗氧化能力相當(dāng)。

4 結(jié) 論

4.1野生牛肝菌粗多糖最佳提取工藝為料液比1∶ 30,溫度80℃,時(shí)間3 h,最佳工藝條件下,得出多糖得率為13.36%。

4.2采用分級(jí)醇沉的方法獲得了不同牛肝菌多糖提取物L(fēng)D-40和LD-80 ,兩種多糖組分LD-40 和 LD-80分別占粗多糖的92.37%、7.63%。

4.3兩種多糖表現(xiàn)出不同的特性,其中 LD-40的粘度及持水力均強(qiáng)于LD-80。兩種多糖抗氧化能力均較弱,但LD-80抗氧化活性遠(yuǎn)高于LD-40。