酵母菌0939-5產(chǎn)揮發(fā)性抑菌物質(zhì)固態(tài)發(fā)酵工藝優(yōu)化

李華靜,王曉東

(1.石河子大學(xué)農(nóng)學(xué)院/新疆綠洲農(nóng)業(yè)病蟲害治理與植保資源利用重點實驗室,新疆石河子 832000)

0 引 言

【研究意義】灰霉孢菌(Botrytiscinerea)是引起果蔬采后真菌性病害的主要病原菌之一。其中,由灰霉孢菌引起的灰霉病是導(dǎo)致葡萄產(chǎn)量和質(zhì)量下降的最主要病害[1]。使用化學(xué)藥劑控制葡萄采后病害方法較陳舊[2-3]。近年來,利用拮抗微生物控制果蔬采后病害是替代化學(xué)殺菌劑的新方法[4-5]。其中拮抗酵母受到關(guān)注[6]。利用拮抗酵母制成生防菌劑對控制葡萄果實采后病害防治有實際意義。【前人研究進展】應(yīng)用于生防菌劑的制備有液態(tài)發(fā)酵或者固態(tài)發(fā)酵兩種方式,但液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基的水分多,產(chǎn)生的廢液也多,易受污染且成本較高[7-8]。而固態(tài)發(fā)酵與液體發(fā)酵相比成本低、產(chǎn)物濃度高、能耗少且應(yīng)用廣泛。田曉麗等[9]研究表明,生防放線菌153以麥麩為基本基質(zhì),并在麥麩中添加適量的玉米粉和小米粉分別作為碳源和氮源,可顯著提高產(chǎn)孢量。俎延喜等[10]研究表明,當(dāng)生防菌34-9發(fā)酵溫度為30℃。發(fā)酵時間32 h,接種量15%,料水比1∶ 1時,可顯著提高生物量。酵母及其產(chǎn)生的揮發(fā)性有機物(Volatile organic compounds, VOCs)在拮抗果蔬采后病害過程中發(fā)揮重要作用[11-13]。利用不同VOCs控制植物病害已有研究[14-16]。Gabler[17]的研究證實,在葡萄的包裝內(nèi)放置Muscodoralbus熏蒸物能夠有效阻止葡萄灰霉的發(fā)生,對控制葡萄儲藏運輸過程中的腐爛變質(zhì)是一種行之有效的方法。黃蓉[18]研究表明,假絲酵母C410產(chǎn)生的揮發(fā)性產(chǎn)物能夠抑制某些真菌,對草莓灰霉病具有顯著的抑制效果。【本研究切入點】酵母菌株0939-5是由課題組前期篩選出的一株生防菌,該菌株能產(chǎn)生揮發(fā)性抑菌物質(zhì),且前期試驗表明該菌株對葡萄灰霉病病菌具有顯著抑菌作用。需將這一菌株發(fā)展為一種生物熏蒸劑。【擬解決的關(guān)鍵問題】以酵母菌株0939-5為研究對象,分析該菌株的固體發(fā)酵和生產(chǎn)工藝,為將其研發(fā)成高效、安全、環(huán)保的微生物熏蒸劑奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材 料

酵母菌株0939-5和葡萄灰霉病菌菌株伊63-2由石河子大學(xué)農(nóng)學(xué)院植保系提供。兩種供試菌株分別接種在PDA平板中,0939-5置于26℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 d后待用;伊63-2放入25℃恒溫箱中培養(yǎng)3 d后,獲取新鮮灰霉菌絲,備用。

1.2 方 法

1.2.1 酵母菌株0939-5產(chǎn)揮發(fā)性抑菌物質(zhì)固態(tài)培養(yǎng)基質(zhì)的篩選

采用雙皿相扣的方法對酵母菌株0939-5產(chǎn)揮發(fā)性抑菌物質(zhì)測定葡萄灰霉病菌的抑菌活性。稱取淀粉、大米粉、糯米粉、小米粉、小麥粉、玉米粉、燕麥粉和黃豆粉各15 g,分別放入編號為A直徑9 cm的培養(yǎng)皿內(nèi),121℃滅菌20 min,取出冷卻后,接入2 mL 1×108CFU/mL的酵母菌懸浮液,且加少量無菌水,攪拌均勻,使初始含水量30%。取另一相同直徑的培養(yǎng)皿B,倒入PDA,冷卻后接入直徑7 mm灰霉菌菌株伊63-2菌餅。去除A、B培養(yǎng)皿皿蓋后,B皿倒扣在A皿上,用封口膜密封后,置于25℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)5 d后,觀察B皿中灰霉菌的生長狀況,測量菌落的半徑。以B皿為對照。每個處理設(shè)3個重復(fù)。

1.2.2 營養(yǎng)成分對酵母菌株0939-5產(chǎn)揮發(fā)性抑菌物質(zhì)活性的影響

1.2.2.1 碳源及其濃度篩選

由1.2.1篩選獲得的最適基質(zhì)為基本固體培養(yǎng)基質(zhì),分別加入葡萄糖、果糖、蔗糖、甘油、可溶性淀粉,使其終濃度為2%,以不加碳源的基質(zhì)為對照。測定最適碳源方法同1.2.1。篩選獲得最佳碳源后,分別設(shè)定其濃度為0%、2%、4%、8%和16%(M/M),同上法測定最適碳源濃度。試驗固體培養(yǎng)基質(zhì)初始含水量為30%。每處理設(shè)3次重復(fù)。

1.2.2.2 氮源及其濃度篩選

分別選取氯化銨、硝酸鉀、尿素和胰蛋白胨加入含有最適碳源濃度的基本固體培養(yǎng)基質(zhì)中,終濃度為1%。氮源及其濃度的篩選具體方法同1.2.2.1。以不加氮源的基質(zhì)為對照。最適氮源的濃度設(shè)定為 0.5%、1%、2%、4%和8%(M/M)。每處理設(shè)3次重復(fù)。

在工業(yè)4.0時代，在數(shù)字化革命中，人造板加工機械制造商正經(jīng)歷著一個理念的變化：要提供的不能僅僅是機械了，不能只把自己當(dāng)作制造者，而要協(xié)助用戶改進他們的企業(yè)。Biesse公司聲稱，已從機械銷售者進展到生產(chǎn)率銷售者。

1.2.2.3 無機鹽及其濃度篩選

分別選取硫酸鎂、氯化鉀、氯化錳和碳酸鈣加入含有最適碳、氮源的基本固體培養(yǎng)基質(zhì)中,終濃度為0.3%。無機鹽及其濃度的篩選具體方法同1.2.2.1。以不加無機鹽的基質(zhì)為對照。最適無機鹽的濃度設(shè)定為0.01%、0.05%、0.1%、0.2%(M/M),每處理設(shè)3次重復(fù)。

1.2.3 培養(yǎng)條件對酵母菌株0939-5產(chǎn)揮發(fā)性物質(zhì)抑菌活性的影響

以上法篩選獲得的固態(tài)發(fā)酵基質(zhì),分別設(shè)置酵母菌接種濃度為0.5×107、1×107、2×107、0.5×108、1×108和2×108CFU/mL;初始酵母接種量為0.5%、1%、2%、5%、10%、15%和20%;初始pH為3、4、5、6、7、8和10及初始含水量為10%、20%、30%、40%、50%和60%。具體測定方法同1.2。每處理設(shè)3次重復(fù)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)利用 Microsoft Excel 進行處理,采用SASS 23.0 統(tǒng)計軟件中的方差分析程序分析差異顯著性。比較處理之間的差異采用 Duncan 氏新復(fù)極差法(P<0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 酵母菌株0939-5產(chǎn)揮發(fā)性抑菌物質(zhì)固態(tài)發(fā)酵基質(zhì)的篩選

研究表明,酵母菌株0939-5在8種供試固態(tài)基質(zhì)中均能產(chǎn)生揮發(fā)性抑菌物質(zhì)且對葡萄灰霉菌的生長具有明顯抑制作用。其中玉米粉、小麥粉、黃豆粉、燕麥粉的抑制效果最好,其抑菌圈半徑分別為35.08、34.91、34.75和34.66 mm,且基質(zhì)間差異不顯著,但與其他4種基質(zhì)的抑制效果之間存在顯著差異。淀粉的抑菌活性最低,抑菌圈半徑為30.41 mm。圖1

2.2 固體基質(zhì)營養(yǎng)成分對酵母菌株0939-5產(chǎn)揮發(fā)性物質(zhì)抑菌活性的影響

2.2.1 碳源及其濃度對酵母菌株0939-5產(chǎn)揮發(fā)性物質(zhì)抑菌活性的影響

注:圖柱上部不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05),以下圖相同

圖2 不同碳源下酵母菌株0939-5產(chǎn)

2.2.2 氮源及其濃度對對酵母菌株0939-5產(chǎn)揮發(fā)性物質(zhì)抑菌活性的影響

研究表明,4種氮源及對照組對酵母菌株0939-5產(chǎn)揮發(fā)性物質(zhì)抑菌活性均有不同程度的影響。胰蛋白胨最有利于提高酵母菌0939-5產(chǎn)揮發(fā)性物質(zhì)抑菌活性,抑菌圈半徑為32.17 mm,且與其它氮源產(chǎn)揮發(fā)性物質(zhì)抑菌活性間差異不顯著。圖4

圖3 不同葡萄糖濃度下酵母菌株0939-5

圖4 不同氮源種類下酵母菌株0939-5

2.2.3 無機鹽及其濃度對對酵母菌株0939-5產(chǎn)揮發(fā)性物質(zhì)抑菌活性的影響

研究表明,4種無機鹽及對照組對酵母菌株0939-5產(chǎn)揮發(fā)性物質(zhì)抑菌活性均有不同程度的影響。當(dāng)添加無機鹽為硫酸鎂時抑菌圈半徑最大,且有利于提高酵母菌株0939-5產(chǎn)揮發(fā)性物質(zhì)抑菌活性,抑菌圈半徑為25.54 mm,且與氯化鉀間產(chǎn)揮發(fā)性物質(zhì)抑菌活性差異不顯著,其抑菌圈半徑分別為25.42 mm;與氯化錳和碳酸鈣產(chǎn)揮發(fā)性物質(zhì)抑菌活性之間存在顯著性差異,抑菌圈半徑分別為15.59和11.75 mm。不同濃度的硫酸鎂均對酵母菌株0939-5產(chǎn)揮發(fā)性物質(zhì)抑菌活性有影響,0.1% MgSO4的抑菌圈最大,為37.42 mm,0.2% MgSO4的抑菌圈最小,為36.25 mm,且與MgSO4抑菌圈存在顯著性差異。圖5,圖6

圖5 不同無機鹽種類下酵母菌株0939-5

圖6 不同硫酸鎂濃度下酵母菌株0939-5

2.3 固體基質(zhì)發(fā)酵條件對酵母菌株0939-5產(chǎn)揮發(fā)性物質(zhì)抑菌活性的影響

2.3.1 接種濃度對酵母菌株0939-5產(chǎn)揮發(fā)性物質(zhì)抑菌活性的影響

研究表明,接種濃度在0.5×107～1×108CFU/mL,酵母菌株0939-5產(chǎn)揮發(fā)性物質(zhì)抑菌活性隨著接種濃度的增加,抑菌圈半徑呈上升趨勢,在接種濃度為1×108CFU/mL時達到最大,為39.00 mm,且與2×108CFU/mL間差異不顯著,抑菌圈半徑為38.58 mm;與0.5×107、1×107和2×107CFU/mL存在顯著性差異,抑菌圈半徑分別為35.83、37.00和37.92 mm。當(dāng)接種量大于1×108CFU/mL時,酵母菌株0939-5抑菌圈半徑呈下降趨勢。圖7

圖7 不同接種濃度下酵母菌株0939-5

2.3.2 初始酵母接種量對酵母菌株0939-5產(chǎn)揮發(fā)性物質(zhì)抑菌活性的影響

研究表明,隨著接種量的增加,菌株的抑菌圈半徑整體呈上升趨勢,在接種量為10%時,達到最大,為32.67 mm,且與接種量15%和20%的抑菌圈半徑間差異不顯著;與接種量0.5%、1%、2%和5%的抑菌圈半徑間存在顯著性差異,抑菌圈半徑分別為10.01、21.67、29.26和28.26 mm。圖8

圖8 初始酵母接種量下酵母菌株0939-5

2.3.3 固態(tài)發(fā)酵基質(zhì)初始pH對酵母菌株0939-5產(chǎn)揮發(fā)性物質(zhì)抑菌活性的影響

研究表明,固體基質(zhì)酸堿度對酵母菌株0939-5產(chǎn)揮發(fā)性物質(zhì)抑菌活性具有不同程度的影響。當(dāng)pH4時,酵母菌株0939-5的抑菌圈半徑最大,為39.00 mm,且與其他pH值相比,存在顯著性差異。pH值為3時,酵母菌株0939-5產(chǎn)揮發(fā)性抑菌物質(zhì)活性最低,抑菌圈半徑為37.00 mm。圖9

圖9 初始pH下酵母菌0939-5

2.3.4 初始含水量對酵母菌株0939-5產(chǎn)揮發(fā)性物質(zhì)抑菌活性的影響

研究表明,培養(yǎng)基固體基質(zhì)中含水量在10%～40%時,隨著固體基質(zhì)中水分含量的增加,菌株的抑菌圈半徑也在逐漸增加。初始含水量為40%時,菌株0939-5抑菌圈半徑最大,為36.38 mm,與含水量20%、30%和50%處理組間差異不顯著,抑菌圈半徑分別為34.71、35.92和34.88 mm;且與含水量10%和60%處理組間存在顯著性差異,抑菌圈半徑分別為25.96和28.88 mm。當(dāng)含水量大于40%時,隨著含水量的增加,菌株的抑菌圈半徑逐漸下降。圖10

圖10 初始含水量下酵母菌株0939-5

3 討 論

固態(tài)發(fā)酵與傳統(tǒng)的深層發(fā)酵相比,具有許多優(yōu)點,包括提高產(chǎn)量、降低能耗、易于產(chǎn)品提取、設(shè)備空間小、減少微生物污染等。更容易恢復(fù)[19-21]。固體發(fā)酵是利用易獲取且價格低廉的農(nóng)副產(chǎn)品及其廢棄物作為發(fā)酵基質(zhì),篩選利于真菌生長的最佳基質(zhì)作為發(fā)酵底物,同時水分含量、接種量、溫度等因素也會影響菌體的生長[22]。王春艷等[23]通過單因素試驗篩選出放線菌LG-9的最佳固態(tài)發(fā)酵底物為小米時,可以獲得較好的發(fā)酵結(jié)果。以玉米粉為固態(tài)發(fā)酵基質(zhì),添加4%葡萄糖、無蛋白胨、0.005%硫酸鎂、0.1%磷酸二氫鉀,5%接種量、培養(yǎng)48 h的條件下,布拉酵母菌與凝結(jié)芽孢桿菌能夠以最佳的生長狀態(tài)生長[24]。由于不同的微生物菌株所需的生長條件不同致使固態(tài)發(fā)酵時的培養(yǎng)條件也有所差異,任加慶等[25]通過單因素試驗發(fā)現(xiàn)在所篩選的培養(yǎng)基成分中,當(dāng)接種量為1.2×106CFU/mL、含水量40%、pH4、培養(yǎng)周期為8 d、吐溫-80含量1%時,在各自組內(nèi)產(chǎn)生的孢子數(shù)最多。不同菌株的最優(yōu)發(fā)酵條件不同,每種菌株都有其特有的生長需求。選擇適合菌株生長的最佳固態(tài)發(fā)酵基質(zhì)和最佳培養(yǎng)條件,可以得到較好的發(fā)酵結(jié)果,且有利于提高所需菌體的產(chǎn)量,使菌體以最佳生長狀態(tài)生長[22]。研究僅采用單因素法進行篩選,未對多因子相互作用對酵母菌株0939-5產(chǎn)揮發(fā)性物質(zhì)的影響作進一步深入研究。

4 結(jié) 論

通過單因素篩選及培養(yǎng)條件的優(yōu)化,獲得以當(dāng)玉米粉為固態(tài)發(fā)酵基質(zhì),分別加入2%葡萄糖和0.1%硫酸鎂;同時接入1×108CFU/mL酵母菌株0939-5懸浮液,接種量為10%;基質(zhì)初始pH為 4,初始含水量為40%,酵母菌 0939-5產(chǎn)揮發(fā)性抑菌物質(zhì)對葡萄灰霉病菌抑制作用最佳。