一種綠色高效獲得藍藻活細胞數的方法探究

倪 敏， 謝沁璇， 李 岱， 周永健， 劉婷婷， 趙藝蒙， 潘 楊，3

（1.蘇州科技大學環境科學與工程學院， 江蘇 蘇州 215009； 2．蘇州科技大學江蘇省環境科學與工程重點實驗室， 江蘇 蘇州 215009； 3．蘇州科技大學城市生活污水資源化利用技術國家地方聯合工程實驗室， 江蘇 蘇州 215009）

藍藻是水華爆發的優勢藻種，分布范圍廣、規模大、持續時間長，其中以微囊藻等為主的優勢種屬代謝產生的藻毒素危害水環境和人類健康。 水華爆發的本質是活性藍藻在適宜條件下的過度增殖，活性藍藻的數量受季節、溫度、營養、pH 等環境因素的影響[1-2]，快速監測活性藍藻數量對預警和防治水華現象的發生具有重要指示作用，需長周期、多樣品、大面積的對活性藍藻進行計數[3]。 常見的面向藻華預警的藍藻細胞計數方法有：（1）2022 年6 月1 日實施的《水質浮游植物的測定0.1 mL 計數框-顯微鏡計數法》（HJ1216-2021）：經魯戈試劑和甲醛固定的藻液，基于藻密度進行稀釋或濃縮后于血球計數板中，經熒光顯微鏡鏡檢計數藻細胞數； 甲醛在2017 年10 月27 日被世界衛生組織國際癌癥研究機構列為一類致癌物，2019 年7 月23 日被我國列入有毒有害水污染物名錄（第一批），該方法使用的甲醛毒性大危害人體，甲醛固定后的藻液屬于危廢，產生次生污染物毒害環境，同時該方法還存在鏡檢觀察耗時長、人力投入大、對藻種識別人員經驗要求高、計數結果是總藻細胞數對藻華預警的指示作用有限等不足[4-5]。 （2）使用流式細胞儀對經SYBR green Ι 和PI 雙染后的藻液分別檢測，獲得各自的DNA 含量，結合已知細胞濃度的標準品DNA 含量獲得染色的總細胞數和死細胞數，進而得出活細胞數；存在操作繁瑣、染料和標準品價格昂貴不易保存、可檢出的細胞濃度范圍（大于100 萬個/L 與顯微計數結果差異較小）有限等缺點[6-7]。 需要建立一種綠色安全、高效快速的藍藻活細胞監測方法。

藍藻氣囊是由眾多圓柱形的氣泡疊加而成，具有明顯的折光特征[8-9]，透射電鏡圖像分析法顯示銅綠微囊藻氣囊占總細胞體積的28%[10]。 藍藻氣囊能夠承受的壓力是0.4～0.7 MPa，超聲或加壓能在不影響細胞活性的前提下使氣囊裂解、氣體溢出[10]。 此外，藍藻不具有細胞核，但細胞中央有顆粒狀或網狀的核物質，易受外界細胞器占位的干擾而改變分布狀態[11]。 PI 可通過死亡細胞的細胞膜進入細胞核，與細胞核中的DNA 結合使其于熒光顯微鏡下觀察呈紅色；與直接染藍藻活細胞的MTT 法、乳酸脫氫酶（LDH）法相比，靈敏性高、穩定性好[12]。研究表明，葉綠素a 濃度可用于反應藻細胞密度[13]。氣囊裂解后是否能夠顯著提高藍藻死細胞的檢出率，藍藻活細胞數與葉綠素a 濃度是否呈線性關系尚未可知。

本研究通過超聲裂解藍藻氣囊，經固定、染色、鏡檢后計數藍藻活細胞數，建立藍藻活細胞數與葉綠素a濃度的標準曲線，獲得待測樣品藍藻活細胞數，可提供一種新的綠色、高效的藍藻活細胞數獲取方法。

1 材料與方法

1.1 藻種培養

本研究以銅綠微囊藻（Microcystis aeruginosa，FACHB-905）作為實驗藻種。 銅綠微囊藻培養基為BG11培養基（購自海博生物），配制方法為：稱取BG11 培養基1.7 g，加熱溶解于1 000 mL 蒸餾水中，分裝，121 ℃高壓滅菌15 min，備用。取500 mL 的培養基，于超凈工作臺中接種50 mL 的種子液，搖晃均勻后在恒溫光照培養箱中，25 ℃、2 000 lx 靜置培養，期間每天搖晃2～3 次，待其長到指數生長期用于后續實驗研究。

1.2 超聲裂解藍藻氣囊與計數

分別取葉綠素a 濃度在30～100 μg/L 的藻液20 mL，在45 kHz 超聲頻率、200 W 超聲功率下使用三頻數控超聲波清洗器（KQ-500VDE 型）分別超聲藻液0、0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4 min。 超聲完畢后，取40 mL 磷酸鹽緩沖液清洗藻液，經3 000～4 000 rpm 離心收集藻液，重復1～2 次去除培養基；將樣品放置在熒光正置顯微鏡下觀察氣囊裂解情況，用移液槍取100 μL 樣品于浮游植物計數框（0.1 mL）中進行計數，每個樣品計100 個細胞、3 個平行重復，有氣囊的記為1，無氣囊的記為0，計算超聲后氣囊的去除率[14]。

1.3 超聲后藻細胞活性檢測

藻細胞活性檢測使用噻唑藍（MTT）試劑盒（碧云天，型號ST316），MTT 溶液的配制方法：取100 mg MTT試劑，使用20 mL 磷酸鹽緩沖液充分溶解，經0.22 μm 濾膜過濾去除溶液中的細菌待用。 取250 μL 樣品，用1/2 濃度的藍藻培養基清洗后，懸于250 μL 的1/2 濃度的培養基中，加入60 μL MTT 貯存液進行染色，于恒溫水浴鍋中35 ℃染色2 h，取10 μL 樣品于血球計數板中，在熒光顯微鏡下計數（尼康NI-U），觀察藍紫色細胞占比即為活細胞占比，每個樣品至少計數300 個細胞、設置三組平行[15-16]。

1.4 未知藍藻活細胞計數

1.4.1 藍藻葉綠素a 濃度測定和活細胞計數

取一份待測藍藻藻液20 mL，進行5 個濃度10 倍梯度稀釋（1 倍、10 倍、100 倍、1 000 倍、10 000 倍），使用浮游植物熒光儀（phyto-PAM，上海澤泉科技股份有限公司）測定5 個濃度梯度稀釋藻液的葉綠素a。 取葉綠素a 濃度在30～100 μg/L 的稀釋藻液20 mL，平均分成兩份，其中一份加入0.1 mL 魯戈試劑黑暗固定48 h（用于總細胞數染色鏡檢），另一份不處理（用于死亡細胞數染色鏡檢），死亡細胞染色鏡檢方法：兩份藻液皆通過4 000 rpm 離心3 min，用磷酸鹽緩沖液清洗3 次，用4 mL 磷酸鹽緩沖液重懸藻細胞，取重懸后的藻液2.0 mL 加入0.5 mL 碘化丙啶（400 μg/mL）溶液，在室溫下染色5 min，用磷酸鹽緩沖液清洗3 次。 各取20 μL 的藻液于血球計數板中，在10x 物鏡下進行顯微鏡鏡檢，計數染色成紅色細胞數。 魯戈試劑固定后的細胞全部死亡，PI 將死亡細胞染成紅色， 依據此原理分別獲得魯戈試劑固定后染色鏡檢的總細胞數減去未經魯戈試劑固定直接染色鏡檢的的死亡細胞數，即可獲得藍藻活細胞數。 各細胞計算具體公式如下：

魯戈氏溶液的配置：取6 g 碘化鉀溶于20 mL 蒸餾水中，攪拌至溶解后，加入4 g 碘，等碘充分溶解后，再加入80 mL 蒸餾水，儲存在棕色試劑瓶中。

磷酸鹽緩沖液（pH 7.0，0.2M）配制：甲液：Na2HPO4，29.3 g；乙液：NaH2PO4，24.35 g；各加水至1 L；取甲液61 mL、乙液39 mL，配制100 mL 磷酸鹽緩沖液。

1.4.2 建立藍藻活細胞數-葉綠素a 濃度標準曲線

測定1.4.1 中5 個濃度梯度稀釋藻液的活細胞葉綠素a 濃度，基于稀釋倍數和鏡檢的活細胞數換算獲得這5 個濃度的藍藻活細胞數，以藍藻活細胞數為X 軸、活藻葉綠素a 濃度為Y 軸建立藍藻活細胞數和藍藻活細胞葉綠素a 濃度的標準曲線。

1.4.3 未知藍藻活細胞數計算

使用葉綠素a 測定儀測定藍藻活細胞的葉綠素a 濃度，帶入1.4.2 中的標準曲線，計算獲得未知樣品的藍藻活細胞數。

2 實驗結果

2.1 超聲對氣囊裂解和細胞活性的影響

為了尋求氣囊破裂細胞活性不變的超聲條件，將藻液在45 kHz、功率200 W 條件下分別超聲0、0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4 min，超聲后的氣囊去除率和細胞死亡率如圖1 所示；圖1 顯示，超聲0～1 min 氣囊裂解較少，超聲1～2.5 min 氣囊逐漸裂解，超聲2.5～4 min 氣囊全部裂解，說明超聲2.5 min（45 kHz、功率200 W）即可使氣囊完全裂解。 與此同時，超聲0～3.5 min 細胞死亡率基本無變化，超聲3.5～4 min 后細胞死亡率增加，說明超聲3.5 min 以上會使細胞裂解而死亡。 綜合氣囊去除率和細胞死亡率的結果可知， 超聲2.5～3.5 min（45 kHz、功率200 W）可在不影響細胞活性的前提下使銅綠微囊藻氣囊裂解。

圖1 不同超聲時間下氣囊的去除率和細胞死亡率

2.2 超聲對死細胞鏡檢計數的影響

對超聲0、0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4 min 的銅綠微囊藻分別進行魯戈試劑固定和PI 染色，經熒光顯微鏡鏡檢計數獲得死細胞的占比結果見圖2；由圖2 可知，在超聲1～2.5 min 時，隨著超聲時間的增加，死細胞占比逐漸增加；超聲2.5～3.5 min 時死細胞占比基本保持不變，這與圖1 的結果一致，說明2.5～3.5 min 對藻細胞活性無影響；與未經超聲（0 min）的藻液相比，超聲2.5～3.5 min（45 kHz、功率200 W）死細胞占比檢出率增加了10.05%，說明超聲使氣囊裂解細胞活性不變的預處理方法有利于提高死細胞的鏡檢檢出率，進而更加準確獲得藻液的活細胞數。

圖2 不同超聲時間后固定和染色鏡檢計算的死細胞占比

2.3 藻活細胞數與活細胞葉綠素a 濃度的標準曲線

將浮游植物熒光儀測定的5 個濃度10 倍梯度稀釋藻液的葉綠素a 濃度（記為Y）與經上述超聲預處理后固定和染色鏡檢計數獲得的活細胞數（記為X）建立標準曲線（見圖3），圖3 中銅綠微囊藻的葉綠素a 濃度Y與活細胞數X的標準曲線線性關系式為y=7×10-7x+10.643，R2=99.73%＞99%，符合標準曲線的線性要求[17-18]，說明此種建立標準曲線的方法較為準確、可行。

圖3 銅綠微囊藻活細胞數和活細胞葉綠素a 濃度的標準曲線

2.4 純藻顯微鏡鏡檢法和快速標準曲線法獲得活細胞數的比較

使用浮游植物熒光儀測定三組未知銅綠微囊藻藻液的葉綠素a 濃度，結果分別為55.79、47.60 和59.01 μg/L， 帶入標曲關系式：y=7×10-7X+10.643， 計算可得未知銅綠微囊藻的活細胞數X分別為6.45×107cells/mL、5.28×107cells/mL 和6.91×107cells/mL（見表1）。 與此同時，使用2.5 min、45 kHz、200 W 的條件分別超聲處理該三組未知銅綠微囊藻2.5 min，經魯戈試劑固定和PI 染色后鏡檢計數死細胞數、總細胞數見表2，將表2 中的總細胞數減去死細胞數， 獲得三組未知銅綠微囊藻的活細胞數C分別為6.32×107cells/mL、5.36×107cells/mL 和6.8×107cells/mL，將表1 和表2 的活細胞數進行顯著性差異分析，P值為0.509＞0.05，說明快速標準曲線獲得純種藍藻活細胞的方法與超聲鏡檢的方法結果無顯著性差異，說明這種快速標準曲線獲得純種藍藻活細胞的方法對預警藍藻水華具有較好的適用性。

表1 快速標準曲線法測定的未知銅綠微囊藻活細胞數

表2 固定和染色后顯微鏡鏡檢法測定的未知銅綠微囊藻活細胞數

2.5 實際水體顯微鏡鏡檢法和快速標準曲線法獲得活細胞數的比較

使用浮游植物熒光儀測定三組未知太湖水樣活性藍藻的葉綠素a 濃度， 結果分別為18.56、15.80 和20.52 μg/L，帶入標曲關系式：y= 4×10-7X+ 7.250 5，計算可得未知太湖水樣藍藻的活細胞數分別為2.83×107cells/mL、2.14×107cells/mL 和3.32×107cells/mL（見表3）。與此同時，使用2.5 min、45 kHz、200 W 的條件分別超聲處理該三組未知太湖水樣藍藻2.5 min，經魯戈試劑固定和PI 染色后鏡檢計數死細胞數、總細胞數見表4，將表4 中的總細胞數減去死細胞數，獲得三組未知太湖水樣藍藻的活細胞數分別為2.96×107cells/mL、2.16×107cells/mL 和3.36×107cells/mL， 將表3 和表4 的活細胞數進行顯著性差異分析，P值為0.202＞0.05，說明快速標準曲線獲得實際水樣藍藻活細胞的方法與超聲鏡檢的方法結果無顯著性差異， 實際水樣的R2=98.33%（見表3）略小于以銅綠微囊藻制作標準曲線的R2（99.73%）（見圖3），這是由于實際的混合藻液中藍藻捕光色素對光譜的吸收和其它藻類有輕微重疊， 造成浮游植物熒光儀檢測的活性藍藻的葉綠素a 濃度存在誤差，其不可避免，所以該方法對于實際水體中水華藍藻的檢測也具有較好的適用性。

表3 快速標準曲線法測定的太湖水樣藍藻活細胞數

表4 固定和染色后顯微鏡鏡檢法測定的太湖水樣藍藻活細胞數

2.6 快速標準曲線法與現行技術的比較

目前常用的藍藻細胞計數方法為 《水質浮游植物的測定0.1 mL 計數框-顯微鏡計數法》（HJ1216-2021），主要用于計數藍藻的總細胞數。現對本研究方法設定應用場景，具體如下：對太湖流域藍藻監測預警，設定監測點位48 個，太湖藍藻爆發時間為6 月份-9 月份，根據藍藻爆發時間設置監測周期4 個月，監測頻次為每周2 次，每個樣品取樣500 mL。 在此條件下快速標準曲線法與行標《水質浮游植物的測定0.1 mL 計數框-顯微鏡計數法》（HJ1216-2021）的對比見表5；根據表5 可知，本研究的快速標準曲線法無需使用甲醛、避免產生危廢等次生污染物、大量節省魯戈試劑的用量，人力投入少，相對標準偏差低，較現行的行標方法綠色高效、準確。

表5 快速標準曲線法與行標方法的比較

3 分析與討論

3.1 快速標準曲線法獲得藍藻活細胞綠色、高效、相對準確

本研究提出的綠色、高效、相對準確獲得藍藻活細胞數的方法基于以下幾點：（1）《水質浮游植物的測定0.1 mL 計數框-顯微鏡計數法（HJ1216-2021）》 中計數藻細胞是使用魯戈試劑和甲醛固定藻液樣品進行鏡檢，甲醛是世界衛生組織國際癌癥研究機構公布的一類致癌物，本研究中的方法無需使用甲醛，綠色環保；（2）藍藻氣囊中含大量氣體，在總細胞體積中占比較大，具有明顯的折光特征[8]，適宜的加壓和超聲處理可使藍藻氣囊裂解細胞活性不變[10]，氣囊裂解后氣體逸出，對顯微成像的折光干擾消失；此外，氣囊裂解后，對藍藻核物質的擠壓和占位影響減小、氣囊下沉，PI 染液與死細胞接觸充分、染色均勻，有利于在顯微鏡下識別和判讀染成紅色的死細胞。 在不改變細胞活性的前提下，與未經超聲處理相比，超聲（2.5 min、45 kHz、功率200 W）裂解藍藻氣囊后進行染色鏡檢可提高10.05%的死細胞檢出率。 （3）浮游植物熒光儀是一款基于不同活性藻類捕光色素對光譜吸收的差異和葉綠素a 熒光檢測技術，實現對樣品中藍藻、綠藻、硅/甲藻的分類和葉綠素a 濃度測定，對不同活性藻類葉綠素a 濃度檢測準確、靈敏、應用廣泛[19-21]。 本研究通過超聲裂解氣囊準確計數藍藻活細胞和浮游植物熒光儀準確測定藍藻活細胞葉綠素a 濃度，建立二者的標準曲線，標準曲線R2＞99%，符合環境監測領域對標準曲線的線性要求[17-18]；只需測定藻華預警的批量藻液葉綠素a 濃度、無需鏡檢即可基于標準曲線獲得活細胞數，高效、相對準確。

3.2 快速標準曲線法的技術改進和標準藻液的選擇

首先，快速標準曲線法獲得藍藻活細胞數依賴于熒光顯微鏡下對于超聲氣囊裂解后染成紅色死細胞的準確識別；藍藻種類繁多、形態多樣，有單細胞、簇狀多細胞和絲狀等[22]，針對這些形態種類繁多的多細胞藍藻，接下來在顯微鏡鏡檢前可加入一定的預處理方法，以保證細胞均勻分散為單細胞便于準確計數。 其次，對于絲狀細胞，有文獻報道將絲狀細胞的總長度作為代替細胞數量的一種統計方法[23]，活性絲狀細胞的總長度與活細胞的葉綠素a 濃度是否存在線性關系需要深入研究。再次，建立標準曲線所用的標準藻液與待測藻液的雜質成分越相似、測定環境條件越統一、來源特征越接近，標準曲線所反映的線性關系越適用于待測藻液，計算的結果也更準確[24]。 最后，鏡檢時藻細胞太稀誤差大，太濃細胞重疊團聚不易識別，選擇葉綠素a 濃度在30～100 μg/L 的稀釋藻液作為標準藻液進行固定和染色后鏡檢計數活細胞， 藻液鏡檢基本不需要進行濃縮或稀釋，為鏡檢標準藻液提供選擇依據。

3.3 快速標準曲線法的應用前景

我國生態環境部《“十四五”生態環境監測規劃》及《江蘇省“十四五”自然生態保護規劃》提出“對藻類水華易發多發的敏感湖庫開展藍藻水華監測預警，提高藍藻打撈與無害化處置能力”等要求。 藍藻水華的本質是活性藍藻的過度增殖，不同條件下藍藻活細胞的占比差異較大；而藻華預警采樣點位多、范圍廣、周期長，現有的方法尤其是基于鏡檢的行標方法 《水質浮游植物的測定0.1 mL 計數框-顯微鏡計數法 （HJ1216-2021）》僅限于計數藍藻總細胞數，未能計數活細胞數；同時使用一類致癌物甲醛進行藻華預警大量樣品的固定后計數，固定后的藻液產生大量的次生污染物危害環境。 本研究提出的快速標準曲線法具有無需使用甲醛和鏡檢，僅通過浮游植物熒光儀測定活性藍藻的葉綠素a 濃度即可獲得活性藍藻的細胞數，綠色高效、準確；面向政府及相關管理部門、科研機構等進行多面積、長周期、大樣品的活性藍藻實時監測，可獲得較為準確的活性藍藻細胞數，符合國家將湖泊治理向生態修復、長效維持進行轉變的戰略需求，必然具備廣闊的市場應用前景。

4 結論

（1）超聲處理（2.5～3.5 min、45 kHz、200 W）可使藍藻氣囊裂解活性不變，進而提高魯戈試劑和PI 染色后鏡檢計數活細胞的準確性（死細胞檢出率增加10.05%）；

（2）浮游植物熒光儀測定的葉綠素a 濃度與超聲裂解氣囊后進行固定、染色、鏡檢獲得的活細胞數建立的標準曲線R2＞99%；

（3）僅通過測定未知藻液的葉綠素a 濃度，基于上述標準曲線即可獲得未知藻液的活細胞數，與經超聲裂解氣囊后進行固定、染色、鏡檢獲得的活細胞數相比無顯著性差異，該方法可應用于基于藻華預警的綠色、高效獲取藍藻活細胞數。