PDCA循環(huán)法在免疫組化染色質(zhì)量控制中的應(yīng)用案例

袁建青 丘利祥 張美先 陳 迪 暨南大學(xué)附屬順德醫(yī)院病理科,廣東省佛山市 528305

免疫組織化學(xué)染色是一種重要的病理診斷技術(shù),依據(jù)抗原抗體特異性結(jié)合的原理,通過對抗體進行特殊標記、顯色,可以檢測到樣本組織內(nèi)是否存在特異性抗原,從而達到區(qū)分組織來源、鑒別腫瘤良惡性、指導(dǎo)特異性靶向治療的目的[1]。但是作為一種實驗技術(shù)手段,免疫組化染色的結(jié)果會受到多種因素影響,難免出現(xiàn)染色不佳的情況,對免疫組化染色的質(zhì)量控制是病理科日常工作中的重要組成部分,各級管理部門亦對此提出了相應(yīng)要求,如何有效解決免疫組化工作中出現(xiàn)的問題,不斷提高工作質(zhì)量并將其保持在穩(wěn)定的高水平狀態(tài)對病理診斷工作的開展是一個不可忽視的問題。我科工作中發(fā)生一起GATA結(jié)合蛋白3(GATA-3)抗體免疫組化染色不良事件,質(zhì)控小組應(yīng)用PDCA循環(huán),最終使問題得以解決,現(xiàn)匯報如下。

1 材料

1.1 實驗材料 GATA-3是轉(zhuǎn)錄因子GATA家族成員,廣泛表達于乳腺導(dǎo)管上皮細胞,顯色于細胞核,常被用于鑒別癌組織是否來源于乳腺[2]。實驗材料選用4個不同患者來源的乳腺組織蠟塊。

1.2 試劑及設(shè)備 免疫組化染色使用基因公司GT-Stainer免疫組化染色儀,一抗(GATA-3)為廈門通靈生物公司即用型抗體,二抗及輔助試劑如修復(fù)液、清洗液等均為基因公司配套免疫組化染色機專用試劑,免疫組化防脫片為世泰公司產(chǎn)品,免疫組化染色方法為二步法。

2 方法

2.1 制定計劃(Plan)

2.1.1 發(fā)現(xiàn)問題:我科免疫組化GATA-3抗體染色結(jié)果出現(xiàn)問題,陽性對照正常乳腺組織內(nèi)GATA-3染色強度減弱,陽性細胞比例極低,不足5%,甚至完全陰性。因以往實驗中該抗體在陽性對照組織中表達較穩(wěn)定,故初步判斷為偶然事件,隨即于當日進行不同對照組織的第2次染色,染色結(jié)果并無明顯改善。

2.1.2 分析問題:從人、機、料、法、環(huán)五個方面著手分析,見1圖。

圖1 免疫組化染色效果問題分析

2.1.2.1 人員:我院為基層醫(yī)院,開放床位700余張,病理科人員配備緊湊,共有醫(yī)師4名,技師4名,科室助理1名,為保證工作質(zhì)量的穩(wěn)定,所有技術(shù)崗位采取輪轉(zhuǎn)制,由4名技師每周進行1次輪換,4名技師均能熟練操作免疫組化染色設(shè)備,科室制定有免疫組化染色的操作規(guī)程和相關(guān)實驗室制度,經(jīng)詢問當班技師,其所有技術(shù)操作均與以往無異,人為操作失誤可能較小。

2.1.2.2 儀器設(shè)備:我科使用基因生物有限公司GT-Stainer免疫組化染色儀,及配套的GT-R100抗原修復(fù)儀,所有儀器設(shè)備均制定有質(zhì)控表格,經(jīng)質(zhì)控小組現(xiàn)場檢查,所有設(shè)備運行良好,近期無故障及維修記錄,且同一批次免疫組化染色,其他抗體陽性對照表達正常,機器故障因素基本排除。

2.1.2.3 物料:本次實驗所用樣本及對照組織均為乳腺組織,其固定時間、固定液種類、固定液用量均按相關(guān)規(guī)定執(zhí)行,且2次實驗已選用不同對照蠟塊,實驗所用樣本及對照組織引起實驗結(jié)果偏差可能較小。所有抗體、試劑、玻片購置、入庫均按照院科兩級相關(guān)制度進行,經(jīng)檢查相關(guān)登記表,所有抗體、試劑及器材均未超過有效期,但GATA-3抗體為新近購置的2支抗體之一,入庫時雖然經(jīng)過有效性驗證,但是否是該支抗體則存疑,而同一批實驗其他抗體顯色均正常,所使用試劑中只有一抗不同,因此一抗(GATA-3即用型抗體)引起實驗結(jié)果偏差的可能較大。

2.1.2.4 實驗方法:我科免疫組化染色所用方法為二步法,2018年10月開始使用基因公司GT-Stainer免疫組化染色儀,相關(guān)操作流程為基因公司工程師經(jīng)過現(xiàn)場實驗調(diào)整設(shè)置,未有變動,免疫組化染色結(jié)果相對穩(wěn)定,染色質(zhì)量有過小的波動,但未曾出現(xiàn)過陽性對照完全陰性的情況,經(jīng)質(zhì)控小組調(diào)查,不同技師切片時,蠟片厚度選擇3.5μm或4μm,略有不同,其后實驗過程基本一致,切片后用免疫組化防脫玻片撈片,72℃溫箱烤片1h,將切片以專用玻片架放置入抗原修復(fù)儀脫蠟修復(fù)20min,修復(fù)完成后,3%H2O2封閉內(nèi)源性過氧化物酶10min,玻片上機,啟動免疫組化染色機日常工作程序,這一步操作過程無須手工操作,完全由儀器按預(yù)定程序進行,包括添加一抗、二抗及蘇木素復(fù)染,染色完成后,使用封片機以中性樹膠封片。經(jīng)質(zhì)控小組分析討論,不同技師操作過程基本相同,不至于引起陽性對照完全陰性的結(jié)果,實驗方法、流程引起GATA-3抗體顯色不佳的可能性不大。

2.1.2.5 環(huán)境:該次實驗時天氣狀況良好,室溫、濕度變化不大,實驗用水為醫(yī)院直供反滲法制備的純凈水,且同批次其他抗體表達良好,環(huán)境影響可能性小。

2.1.3 查找原因:結(jié)合以上調(diào)查結(jié)果,質(zhì)控小組討論后認為試劑(GATA-3即用型抗體)原因?qū)е聦嶒炇〉目赡苄暂^大。

2.1.4 設(shè)定目標,制定計劃:計劃針對人、機、料、法、環(huán)五個方面分別采取對照試驗,以達到明確原因,解決問題的目的,目標為正常乳腺組織GATA-3抗體免疫組化染色細胞核呈明顯的棕黃色,陽性細胞≥80%,爭取1周內(nèi)解決問題。

2.2 執(zhí)行計劃(Do)

2.2.1 排除人為操作失誤及樣本因素:選取2個正常乳腺組織蠟塊,4μm切片,撈于同一玻片,共制片2張,由2名技師分別進行GATA-3抗體免疫組化染色,染色步驟及其他實驗條件相同,2名技師染色結(jié)果基本一致,所有乳腺組織GATA-3表達均不理想。

2.2.2 排除儀器故障因素:選取2個正常乳腺組織蠟塊,4μm切片,撈于同一玻片,共制片2張,由同一名技師分別進行GATA-3抗體免疫組化手工和機器染色,染色步驟及其他實驗條件相同,染色結(jié)果顯示手工染色陽性細胞數(shù)及染色強度略好于機器染色結(jié)果,但陽性細胞<10%,未達計劃目標要求。

2.2.3 排除樣本及試劑因素:分別將我科用于實驗的同一乳腺組織樣本白片寄送廈門通靈公司及上海基因公司,由以上公司實驗室進行GATA-3抗體染色,2家公司染色結(jié)果均為正常顯色,提示可以排除樣本因素。將我科剩余GATA-3抗體寄送通靈公司,由其進行GATA-3抗體染色,染色結(jié)果均為正常顯色,提示可以排除試劑因素。由通靈公司及基因公司分別提供新的GATA-3即用型抗體一支,選取2個正常乳腺組織蠟塊,4um切片,撈于同一玻片,共制片2張,由1名技師用2支抗體分別進行GATA-3抗體免疫組化染色,染色步驟及其他實驗條件相同,染色結(jié)果基本一致,所有乳腺組織GATA-3表達均不理想。

2.2.4 排除環(huán)境因素:所有實驗均在室溫26℃(空調(diào))下進行,除GATA-3抗體外,同時期其他抗體顯色均正常,環(huán)境因素可以排除。

2.3 檢查工作(Check) 經(jīng)過以上步驟排查,質(zhì)控小組認為可以排除人員、儀器、試劑、環(huán)境等因素造成GATA-3抗體染色不佳的可能性,提示染色方法及流程引起此次事件的可能較大。

2.4 處理(Action) 經(jīng)查閱GATA-3抗體和二抗使用說明書,及通靈公司、基因公司產(chǎn)品手冊中與免疫組化染色操作步驟相關(guān)的內(nèi)容,發(fā)現(xiàn)GATA-3抗體說明書中建議在染色時,先對脫蠟后的組織切片進行封閉,再進行抗原修復(fù),與我科日常工作流程不相符,為此質(zhì)控小組決定修改染色流程,將先修復(fù)再封閉改為先封閉再修復(fù),并重新進行實驗。此次實驗,乳腺腺泡及導(dǎo)管上皮細胞核呈明顯的棕黃色,陽性細胞>90%,GATA-3抗體顯色正常。

3 結(jié)果

為了驗證效果,質(zhì)控小組再次復(fù)查以上PDCA循環(huán)流程,并分別使用通靈公司及基因公司的GATA-3即用型抗體,以新的染色操作流程對乳腺組織進行染色,實驗結(jié)果乳腺腺泡及導(dǎo)管上皮細胞核顯色正常,完全達到計劃目標,因此,質(zhì)控小組決定對GATA-3免疫組化染色操作流程進行修改,以保持染色效果。此次PDCA循環(huán)的運行,也暴露出科室抗體管理、工作流程等方面的一些漏洞和疏忽,質(zhì)控小組要求以后在抗體入庫做有效性檢驗時記錄要更加詳細,同時技術(shù)組要在抗體入庫時詳細閱讀使用說明書,對有特殊處理要求的抗體要記錄在案。

4 討論

免疫組織化學(xué)染色操作簡便,對實驗設(shè)備及環(huán)境要求低,成本相對低廉,易于在基層醫(yī)院開展,對病理診斷及鑒別診斷有著不可替代的重要作用,但是免疫組化染色的結(jié)果易受人員、設(shè)備、試劑、操作流程、環(huán)境等多種因素影響,日常工作中難免會出現(xiàn)染色不良的事件,如何快速有效的發(fā)現(xiàn)并解決主要問題,對病理質(zhì)控工作的開展是一項挑戰(zhàn)。PDCA循環(huán)是由1924 年美國人Waller Shewhart 提出,并由Deming改進后的一種管理方法[3],通過Plan(計劃)、Do(執(zhí)行)、Check(檢查)、Action(處理)這四個階段的循環(huán)進行,可以達到解決問題,改進質(zhì)量的目的。作為一種先進的管理方法,PDCA循環(huán)已被用于病理石蠟切片HE染色、特殊染色及免疫組化染色的持續(xù)改進工作中,并取得了良好的效果[4-6]。

此次我科GATA-3抗體免疫組化染色結(jié)果不良問題出現(xiàn)后,科室隨即進行了重復(fù)實驗,排除了偶發(fā)事件的可能,面對以上紛繁復(fù)雜的多種因素,質(zhì)控小組決定應(yīng)用PDCA循環(huán),來查找原因,并解決問題。首先質(zhì)控小組與此次實驗的操作人員進行了談話,了解了詳細的實驗過程,并查看了相關(guān)的工作記錄及試劑出入庫、驗證記錄等文書,結(jié)合設(shè)備狀態(tài)及實驗環(huán)境,初步做出了判斷,認為實驗結(jié)果不良可能是試劑原因造成。為了驗證這種想法進而制定了對應(yīng)的工作計劃,從人、機、料、法、環(huán)五個方面著手,分別進行對照實驗。實驗結(jié)果卻推翻了質(zhì)控小組的初步判斷,新的抗體顯色仍然不良,而上述懷疑有問題的抗體在送去試劑公司實驗后卻顯色正常,結(jié)合其他方面的驗證結(jié)果,實驗方法及流程錯誤的可能性反而更大。在第二輪PDCA中,發(fā)現(xiàn)GATA-3抗體說明書中建議在染色時,先對脫蠟后的組織切片進行封閉,再進行抗原修復(fù),與我科日常工作流程不相符,與免疫組化染色儀廠家設(shè)定的固有程序不同,有可能是導(dǎo)致染色不良的主要原因,在采取相應(yīng)改進并實驗驗證后,問題得以圓滿解決。通過此次PDCA循環(huán)的應(yīng)用,筆者深刻地認識到,在遂行PDCA循環(huán),分析事件原因時要保持嚴謹、客觀的工作態(tài)度,以免做出錯誤的判斷,我科在第一輪PDCA循環(huán)中,忽略了一抗與二抗分屬不同廠家,實驗流程可能不同的情況,僅主觀地依據(jù)日常工作經(jīng)驗,未能對抗體說明書等資料進行認真核對,錯誤認為染色不良是由試劑引起的,幸而接下來的計劃、執(zhí)行與檢查步驟較為完善,為查明問題的主要原因提示了方向,這進一步驗證了PDCA循環(huán)的可行性,顯示在免疫組化染色質(zhì)量控制中使用PDCA循環(huán)法,對于分析、查找出引起問題的主要原因,可以做到步驟明確,條理清晰,客觀明了,可不斷提升和持續(xù)改進病理工作質(zhì)量,是一種有效的管理方法。同時也提醒,再良好的工具,在使用時也必須以認真負責(zé)的工作態(tài)度加以對待,才能使其發(fā)揮出真正的作用。