Wnt/β-catenin通路在新北美圣草苷促進BMSCs成骨分化中的介導(dǎo)作用*

曾文叢 曾芳俊 何 偉

江西省贛州市人民醫(yī)院脊柱外科 341000

骨質(zhì)疏松癥是臨床中老年人和絕經(jīng)后女性的常見病癥,以骨組織微結(jié)構(gòu)改變、骨量減少為主要特征,進而引起骨骼脆性增加、強度下降,是一種系統(tǒng)性代謝骨病。骨髓間充質(zhì)干細胞(Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells,BMSCs)具有多向分化能力,可以定向分化為神經(jīng)元、成骨細胞、軟骨細胞及脂肪細胞等,研究證實,BMSCs所分化的成骨細胞在骨組織形成、維持和重建等過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用,骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生發(fā)展與BMSCs分化失衡關(guān)系密切[1]。BMSCs成骨分化過程受到多個通路調(diào)節(jié),如MAPKK通路、Wnt/β-catenin通路、Notch通路及RANKL/RANK/OPG通路等,而經(jīng)典Wnt/β-catenin通路已被證實是BMSCs成骨分化的關(guān)鍵通路[2-3]。骨碎補取自蕨類植物槲蕨的根莖,是骨科中常用的中藥,具有補腰腎強筋骨、止痛續(xù)傷的作用,可有效緩解骨質(zhì)疏松癥狀[4],但具體作用機制尚無明確闡述。新北美圣草苷(Neoeriocitrin)是骨碎補的主要成分之一。本研究采用體外培養(yǎng)的研究方法,以BMSCs作為靶細胞,探討新北美圣草苷調(diào)節(jié)其成骨分化的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與試劑器材

1.1.1 實驗動物:選取SPF級3月齡大鼠30只,體重(200±20)g,購于濟南朋悅實驗動物繁育有限公司,批號:SCXK(魯)20140007。

1.1.2 主要實驗藥品、試劑及實驗器材:骨碎補購于中藥房;南美胎牛血清(Hy-Clone,批號:NZJ1221);堿性磷酸酶染液(南京建生成物,批號:20160818);β-甘油磷酸鈉(上海源葉生物,批號:S20S7G21494);堿性磷酸酶檢測試劑盒(南京建成生物,批號:20160813);大鼠β-catenin ELISA kit(武漢基因美,批號GR201612-1);Transcriptor Frist Strand cDNA Synthesis Kit(Roche,批號13713422);逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(大連寶生物)。高速冷凍離心機(Neofuge23R,上海力康);顯微鏡(OLYMPUS/IX71,日本奧林巴斯);酶聯(lián)免疫儀(Biotek Elx800,美國伯騰);CO2培養(yǎng)箱(HF160W,上海力康);恒溫水浴鍋(HH-2,江蘇金壇榮華);流式細胞儀(BD FACSVERSE,美國);超潔凈工作臺(SW-CJ-2FD,上海博訊實業(yè))。

1.2 實驗方法

1.2.1 新北美圣草苷含藥血清制備:依據(jù)成人患者每日所進藥量換算得出大鼠用藥量,采用水煎法將骨碎補藥液濃縮,儲存于4℃?zhèn)溆?使用前恢復(fù)至室溫。將大鼠依照隨機數(shù)字表法隨機分為對照組、低劑量組、高劑量組,每組10只大鼠。每日早8點和下午2點進行灌胃處置,劑量如下:低劑量組灌服0.81g/kg骨碎補水煎液,高劑量組灌服4.05g/kg骨碎補水煎液,對照組灌服等體積生理鹽水。連續(xù)灌胃干預(yù)3d。末次灌胃1.5h后,取大鼠腹主動脈血,以4℃、2 500r/min離心20min后,取上層清液,經(jīng)56℃水浴滅活后過濾,-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 BMSCs培養(yǎng)與擴增:選用全脊髓貼壁法制備BMSCs:將大鼠麻醉后,于75%乙醇溶液內(nèi)浸泡10min,于超潔凈工作臺上分離大鼠股骨,繼續(xù)置于75%乙醇溶液中浸泡20s后,取出股骨干骺端。隨后以100kU/L青霉素、鏈霉素合并10%胎牛血清與L-DMEM培養(yǎng)基反復(fù)沖洗大鼠股骨髓腔至股骨表面微亮。將髓腔沖洗液收集后置于25ml培養(yǎng)瓶內(nèi),放入5%CO2培養(yǎng)箱,37℃繼續(xù)培養(yǎng)。24h后換液1次,隨后每2d換液1次。當(dāng)80%以上細胞融合后,選取0.25%胰蛋白酶進行消化,依照1∶3進行傳代培養(yǎng)。選取第三代生長較好的細胞,應(yīng)用流式細胞儀對所培育細胞表面抗原進行檢測,確定其免疫表型。

1.2.3 細胞分組及給藥:將細胞分為對照組、低劑量組、高劑量組。低劑量組細胞給予L-DMEM、成骨分化誘導(dǎo)液和10%低劑量含藥血清;高劑量組細胞給予L-DMEM、成骨分化誘導(dǎo)液和10%高劑量含藥血清;對照組細胞給予L-DMEM、100kU/L青霉素和100kU/L鏈霉素,成骨分化誘導(dǎo)液及10%胎牛血清培養(yǎng)基。連續(xù)干預(yù)10d。

1.3 實驗指標(biāo)

1.3.1 BMSCs的鑒定:研究證實,BMSCs表面抗原標(biāo)記對CD34、CD45等陰性反應(yīng),對CD29、CD104、CD44等陽性反應(yīng)。選用0.25%胰蛋白酶消化細胞后,制備單細胞懸液,以1 500r/min離心3min后進行PBS重懸,細胞濃度為2×105/ml。PBS沖洗2次后,取400μl細胞懸液,加入PE、APC、FITC標(biāo)記的抗體,隨后避光條件下孵育40min,再以PBS沖洗1次,以流式細胞儀進行檢測。

1.3.2 細胞增殖水平比較:選取第三代生長良好的細胞,制備為單細胞懸液,以1×104/mm接種于96孔培養(yǎng)板,每孔滴入100μl細胞懸液。各組設(shè)置6個復(fù)孔,加入各組對應(yīng)的培養(yǎng)基,隨后置于5%CO2培養(yǎng)箱,37℃繼續(xù)培養(yǎng)。于培養(yǎng)的第3、5、7、9天取出板進行檢測。向每孔內(nèi)滴加10μl CCK-8,37℃條件下孵育4h。在酶標(biāo)儀中選取490nm波長,檢測各孔吸光度(A)。各組細胞增殖水平以A490吸光度值表示。

1.3.3 BMSCs礦化能力比較:將第三代BMSCs接種于6孔板上,各組設(shè)置3個復(fù)孔。待培養(yǎng)至21d時,去掉培養(yǎng)液以PBS沖洗,使用95%乙醇溶液將細胞固定30min,隨后以0.2%茜素紅染色30min,以清水沖洗。將細胞置于40倍光鏡下觀察拍照,并計算各組的礦化結(jié)節(jié)數(shù)量。

1.3.4 成骨相關(guān)mRNA及Wnt/β-catenin通路相關(guān)mRNA表達水平比較: 將BMSCs以1×104/ml接種于6孔板內(nèi),待瓶底80%以上被細胞鋪滿時,分別加入各自的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng),每2d進行1次換液。培養(yǎng)7d后,提取各組細胞總RNA,選用光度計檢測RNA純度在1.8～2.2范圍內(nèi)則認為總RNA純度較好,可用于后續(xù)檢測,置于-80℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆谩⒖寄孓D(zhuǎn)錄試劑盒說明書進行操作,于冰上加入4μl 5×Primescript buffer,Oligo dT primer、Primescript RT Enzyme mix I、Random 6 mers各1μl,1μg總RNA,隨后滴加RNase Free ddH2O至20μl,反應(yīng)體系即配置成功。隨后進行反轉(zhuǎn)錄:37℃ 15min,85℃ 5s,4℃條件下保存。參照試劑盒操作步驟說明進行操作,反應(yīng)條件:95℃ 5min,95℃ 20s,62℃ 15s,72℃ 15s,72℃ 5min,其中后4個步驟循環(huán)45次。檢測mRNA的表達情況,由程序生成標(biāo)準(zhǔn)曲線,記錄CT值,并計算各組mRNA/空白組mRNA倍數(shù)。RT-PCR引物由生工生物工程公司合成,引物序列詳見表1。

表1 引物基因序列

1.3.5 β-catenin蛋白、Lrp-5蛋白水平比較:各組取培養(yǎng)7d的BMSCs細胞,每組取6孔,依照下方操作步驟提取總蛋白:胰蛋白酶消化細胞,4℃ 1 500r/min 離心5min,隨后以PBS沖洗3次,估算細胞總體積。將樣本置于冰面,加入RIPA裂解液后,反應(yīng)30min。4℃ 12 000r/min 離心10min,取上層清液,依據(jù)試劑盒操作步驟檢測β-catenin蛋白及LRP蛋白表達水平。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 選用SPSS20.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析,計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,采用單因素方差分析。以P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 BMSCs形態(tài)及表型鑒定 接種初,其他細胞與BMSCs混雜,細胞呈圓形。24h后細胞開始貼壁生長,呈紡錘狀,細胞數(shù)目較少。48h后可見部分細胞呈短梭形,有偽足(見圖1a)。3d后貼壁細胞數(shù)量增加同時體積增大,細胞逐漸伸展為多角形、梭形,成簇生長(見圖1b)。8d左右出現(xiàn)相互融合。10d左右細胞融合狀態(tài)可達80%以上(圖1c)。流式細胞儀檢測結(jié)果顯示,表面CD44、CD29、CD45陽性細胞比例分別為95.30%、94.25%、0.40%,結(jié)合形態(tài)觀察結(jié)果可以確認所培養(yǎng)細胞為BMSCs。

圖1 BMSCs形態(tài)學(xué)觀察

2.2 各組BMSCs細胞增殖水平比較 與對照組相比,給藥兩組各時間點吸光度值明顯增加,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);同時與低劑量組相比,高劑量組在各時間點吸光度值均明顯升高,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);低劑量組、高劑量組在3～5d的促增殖作用更明顯。詳見表2。

表2 各組BMSCs細胞增殖水平比較

2.3 各組BMSCs礦化能力比較 在干預(yù)21d后,各組BMSCs均形成礦化結(jié)節(jié)。經(jīng)茜素紅染色后表現(xiàn)為大小不等的紅色致密結(jié)節(jié)。三組礦化結(jié)節(jié)數(shù)量顯示:高劑量組(15.35±4.10)>低劑量組(11.24±2.61)>對照組(5.33±1.21),差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

2.4 各組β-catenin、Lrp-5、Osterix、RUNX-2、Gsk-3β mRNA表達水平比較 干預(yù)7d后,給藥兩組的GSK-3β mRNA表達明顯低于對照組,且高劑量組低于低劑量組;β-catenin、Lrp-5、Osterix、RUNX-2 mRNA表達明顯高于對照組,且高劑量組高于低劑量組,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。詳見表3。

表3 各組β-catenin、Lrp-5、Osterix、RUNX-2、Gsk-3β mRNA表達水平比較

2.5 各組β-catenin蛋白、Lrp-5蛋白水平比較 干預(yù)7d后,給藥兩組的β-catenin蛋白、Lrp-5蛋白水平明顯高于對照組,且高劑量組高于低劑量組,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。詳見表4、圖2。

圖2 β-catenin、Lrp-5蛋白的表達

表4 各組β-catenin蛋白、Lrp-5蛋白水平比較

3 討論

骨質(zhì)疏松是引起中老年人骨折的主要原因之一,嚴重影響患者的日常生活,且增加社會醫(yī)療負擔(dān)[3]。人體骨骼的細胞成分主要為骨細胞,約占細胞總數(shù)的90%。骨細胞具有內(nèi)分泌功能和傳導(dǎo)功能,同時可以感受機械刺激并轉(zhuǎn)化為生物信號,對外界變化的力學(xué)環(huán)境產(chǎn)生適應(yīng)性變化,調(diào)控成骨細胞和破骨細胞動態(tài)平衡,進行骨骼重建[2,5]。

骨質(zhì)疏松癥在傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中被歸入“痿病”“虛勞”“骨痿”等證的范疇,中醫(yī)理論認為,骨生長發(fā)育狀態(tài)與腎精充沛與否關(guān)系密切[6-7]。《黃帝內(nèi)經(jīng)》有“腎者,主骨生髓”以及“腎氣熱,則腰脊不舉,骨枯而髓減”等論述,提示本病的病位主要在腎,故當(dāng)以補腰腎強筋骨論治。以干細胞為理論基礎(chǔ)的骨再生技術(shù)近年來成為骨缺損和骨質(zhì)疏松癥等多種骨科疾病的熱點技術(shù),其中促進干細胞成骨分化及自我更新是該治療技術(shù)的核心[8-9]。

骨碎補是補腎壯骨類中藥,相關(guān)體外研究證實[10],骨碎補對BMSCs有促進增殖和促進成骨分化的作用,新北美圣草苷正是其主要成分。故本研究中以BMSCs為靶細胞,探究新北美圣草苷促進其成骨分化的具體作用機制。

BMSCs經(jīng)誘導(dǎo)可分化為脂肪細胞、軟骨細胞、成骨細胞等,其成骨分化在骨組織的維持與重建中發(fā)揮重要作用[11]。本研究結(jié)果顯示,低劑量組與高劑量組細胞吸光度明顯高于對照組,提示含藥血清可明顯促進BMSCs的增殖作用,且3～5d時作用較明顯,7～9d時增殖速度較緩慢可能與培養(yǎng)器材的限制相關(guān),細胞密度達到了一定值。而劉偉等研究發(fā)現(xiàn)高濃度骨碎補提取物可產(chǎn)生抑制作用甚至毒副作用,在后續(xù)實驗中可增加更高濃度組進行研究。同時給藥兩組的礦化結(jié)節(jié)數(shù)量明顯高于對照組,高劑量組高于低劑量組,提示高濃度含藥血清可有效促進BMSCs向礦化細胞及成骨細胞分化。

BMSCs成骨分化受多條通路的調(diào)控,其中經(jīng)典Wnt/β-catenin通路發(fā)揮關(guān)鍵作用。β-catenin是經(jīng)典Wnt/β-catenin通路的關(guān)鍵因子,其濃度與Wnt通路是否激活關(guān)系密切,同時其在細胞定性分化和細胞增殖中也起到關(guān)鍵作用[12-13]。當(dāng)Wnt蛋白與Lrp-5/6及Frizzled受體結(jié)合后,細胞內(nèi)散落蛋白被激活并激活下游GSK-3β的結(jié)合蛋白,而GSK-3β的結(jié)合蛋白可以下調(diào)β-catenin被GSK-3β的磷酸化程度,進而調(diào)控目標(biāo)基因的表達[14]。RUNX2可以通過增加Ⅰ型膠原、骨橋蛋白及骨鈣素等相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄進而促進BMSCs的成骨分化,其下游因子Osterix也是調(diào)控BMSCs成骨分化的重要因子[15-16]。本研究結(jié)果顯示,BMSCs經(jīng)誘導(dǎo)后,GSK-3β mRNA表達下調(diào)同時β-catenin、Lrp-5、Osterix、RUNX-2 mRNA上調(diào),而β-catenin蛋白、Lrp-5蛋白水平均升高,且高劑量組優(yōu)于低劑量組,提示含藥血清能夠調(diào)控Wnt/β-catenin通路相關(guān)蛋白及mRNA表達,進而促進BMSCs成骨分化。

綜上所述,新北美圣草苷可以促進BMSCs的成骨分化及細胞增殖,可能與激活Wnt/β-catenin通路,下調(diào)GSK-3β mRNA表達,同時上調(diào)β-catenin、Lrp-5、Osterix、RUNX-2 mRNA,提高β-catenin蛋白、Lrp-5蛋白水平相關(guān)。