通心絡對高脂血癥兔頸動脈外膜微血管新生的影響及機制

劉美之 邊愛忠 王俊林 孫愛敏 安香珍 姚俊葉

(1石家莊市人民醫院,河北 石家莊 050000;2衡水市景縣中醫院;3邯鄲邯鋼醫院)

血管新生是在原有毛細血管基礎上通過血管內皮細胞遷移、增殖等步驟,以芽生或分隔形式形成新血管的生物學過程。滋養血管主要起源于大動脈外膜的微血管網,這些微血管為動脈管壁外層提供氧和營養物質。血管新生是動脈粥樣硬化血管病變的重要特征,外膜微血管新生伴隨動脈硬化的病理過程。外膜微血管密度(MVD)增加被認為是斑塊形成過程中動脈壁增厚的反應。有證據顯示這種增生反應先于內皮功能障礙、內膜形成或斑塊形成〔1,2〕。外膜微血管被認為是炎癥介質或細胞進入血管壁的通道,最終可導致斑塊形成,加速疾病的發展〔3,4〕?？寡苄律委熆梢杂行У亟档屯饽VD,延緩斑塊進展〔5,6〕。神經和血管在組織中構成復雜的分支網絡,在解剖和功能方面有著密切聯系〔7〕。血管生成過程不僅需要完整的內皮細胞,外周神經系統也是重要參與者。組織學研究發現在動脈外膜與中膜交界處分布著大量去甲腎上腺素能和膽堿能神經纖維,可釋放多種神經遞質促進血管新生〔8,9〕。在胚胎發育中,血管外周神經可以引導血管分支的結構形成和動脈分化〔10,11〕。神經肽(NPY)、神經生長因子(NGF)是從交感神經釋放支配心血管的神經遞質,有潛在的促血管新生作用。體外實驗證實NPY可以促進人內皮細胞黏附、遷移、增殖和毛細血管管腔形成〔12,13〕。在大鼠后肢缺血模型中,局部應用NPY能夠顯著增加血管性血友病因子(vWF)和CD31陽性血管的密度,促進缺血組織的血管新生〔14〕。另外有文獻報道神經調節似乎參與誘導了新生微血管的成熟和穩定〔15〕。本研究主要探討通心絡對高脂血癥兔頸動脈外膜微血管新生的影響及機制。

1 材料與方法

1.1實驗動物 普通級健康新西蘭白兔,3～4月齡,雄性,平均體質量(2.0±0.2)kg,購自北京富豪實驗動物養殖中心,實驗動物許可證號SCXK(京)2010-0010。

1.2模型建立及分組、藥物治療 參照文獻〔16〕,建立硅膠管包裹兔右頸總動脈模型:3%戊巴比妥鈉(1 ml/kg)經耳緣靜脈麻醉,待麻醉脫毛后,將兔仰臥位固定于手術臺上。常規消毒,鋪洞巾。沿其頸部正中線甲狀軟骨下方剪開皮膚并逐層鈍性分離各層,暴露右側頸總動脈鞘,仔細游離出3～4 cm頸動脈,采用醫用硅膠管,長20 mm,內徑1.7 mm,外徑3.2 mm,縱向切開后包裹于新西蘭兔的右頸總動脈,生理鹽水沖洗,縫合傷口,局部滴加青霉素鈉。術后,連續3 d,1次/d,局部滴加青霉素鈉80萬U/d,預防感染。

實驗兔90只,適應性喂養1 w后,頸動脈套管術后隨機分為正常組、模型組、低劑量通心絡組、中劑量通心絡組、高劑量通心絡組和阿托伐他汀組,每組15只。正常組全程給予普通飼料,其余各組給予高脂飼料(配方為膽固醇1%,豬油5%,蛋黃粉7.5%,基礎飼料86.5%),飼料由河北省實驗動物中心加工定制,每兔每日限量喂食120 g。高、中、低劑量通心絡組分別給予通心絡超微粉0.60、0.30、0.15 g/(kg·d)。阿托伐他汀組給予阿托伐他汀2.50 mg/(kg·d)灌胃給藥。先配制一定濃度的藥物,然后按照3 ml/kg體質量標準灌胃。頸動脈套管術后次日開始灌胃給藥,正常組、模型組按3 ml/kg體質量標準給予0.5%羧甲基纖維素鈉溶液,實驗周期為4 w。

1.3標本采集 各組實驗動物于4 w末取材,取材前,動物禁食12 h,使用3%戊巴比妥鈉1 ml/kg處死動物,獲取右頸總動脈,冰生理鹽水沖洗后,小心剝離外周附著的結締組織。取材組織一段置于10%的中性甲醛溶液中固定,留做石蠟切片,備用馬松(Masson)染色和免疫組化、免疫熒光實驗。整個過程保持無菌操作,動作迅速。另外每組隨機選取3只動物,彩色微球實驗檢測右頸動脈壁微血管血流量。

1.4Masson染色 切片脫蠟至水,鐵蘇木素染色液(Weigert)5～10 min,1%鹽酸酒精分化,麗春紅酸性品紅液染5～10 min,1%磷鉬酸水溶液處理5 min,苯胺藍液復染5 min,1%冰醋酸處理1 min,95%酒精脫水,無水酒精脫水,二甲苯透明,中性樹膠封固。結果為膠原纖維呈綠色,血管壁平滑肌細胞呈紅色,胞核呈藍褐色。

1.5免疫組織化學 采用即用型快速酶免疫組化染色方法檢測VEGF、CD31在頸動脈組織的定位和表達。在石蠟切片脫蠟后,將厚度5 μm頸動脈標本切片放入3%過氧化氫(H2O2)溶液,阻斷內源性過氧化物酶。用5%牛血清白蛋白(BSA)按一定比例稀釋好的一抗(CD31 1∶200 Abcam UK;VEGF 1∶200 Abcam UK)覆蓋標本組織,4 ℃孵育過夜。添加辣根過氧化物酶(HRP)標記的二抗覆蓋組織,二氨基聯苯胺(DAB)顯色。蘇木素復染細胞核,脫水透明封片,在光學顯微鏡下觀察。結果判定:VEGF陽性染色為位于細胞質的棕黃色顆粒,根據陽性細胞數及陽性信號出現的位置綜合判斷結果,參照文獻〔17〕采用半定量積分法,根據陽性細胞率和陽性細胞著色強度分別記分。CD31陽性著色部位為胞膜或胞質,采用Weidner等〔18〕提出的方法進行CD31標記的MVD量化分析。首先在40倍光鏡視野下掃視整個切片尋找微血管高密度集中區域作為“熱點”,然后在400倍光鏡視野下隨機計數5個高倍視野,取其平均值作為該標本的MVD。

1.6免疫熒光 石蠟切片脫蠟至水,抗原修復后,滴加用5%BSA按一定比例稀一抗〔酪氨酸羥化酶(TH)1∶100 Abcam UK;NPY 1∶200 Abcam UK〕覆蓋組織,切片平放于濕盒內4 ℃孵育過夜。玻片置于磷酸鹽緩沖液(PBS,pH7.4)中在脫色搖床上晃動洗滌3次,每次5 min,滴加與一抗相應種屬的二抗覆蓋組織,避光室溫孵育60 min。將玻片置于PBS(pH7.4)中在脫色搖床上晃動洗滌3次,每次5 min。4,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)復染細胞核:玻片置于PBS(pH7.4)中在脫色搖床上晃動洗滌3次,每次5 min。切片稍甩干后在圈內滴加DAPI染液,避光室溫孵育10 min,切片稍甩干后用抗熒光淬滅封片劑封片,于IX71 熒光倒置顯微鏡下觀察并采集圖像。

1.7心肌血流量(MBF)檢測 彩色微球血流測量系統(Triton Technology,Inc.,USA)檢測頸動脈壁滋養血管的血流量。動物麻醉、固定,股動脈插管,然后剪斷二、三、四肋骨,暴露心臟,將0.3 ml含有2.1×105個黃色微球(最大吸光度波長448 nm)懸浮液與0.2 ml 0.05%吐溫混合液在10 s內用注射器直接注入左心室。留取血液及組織標本:在微球注射后5 s開始勻速股動脈采血,持續1 min。股動脈采血后立即取右頸總動脈段。血樣本及各組織樣本分置于提前稱重的15 ml或50 ml聚丙烯離心管中。再次稱重后計算血樣本及組織重量。每個離心管中加入濃度為1.0×105個/ml藍色微球懸浮液100 μl作為內控。通過強堿溶解,沉降法回收嵌頓在頸動脈組織的微球。使用酸化乙氧乙酸乙酯200 μl萃取微球表面的染料,紫外可見光分光光度計檢測吸光度值以計算評估各待測器官或組織的微血管血流量,將所得實驗數據輸入Triton Technology公司提供的軟件,計算出各組MBF。

2 結 果

2.1頸動脈Masson染色 如圖1所示,平滑肌細胞被染成紅色,膠原纖維呈藍色。正常組腹主動脈大體觀察呈乳白色,內膜平整光滑,未見脂質沉積,模型組腹主動脈段內膜出現多病灶、散在的脂質沉積,脂質成分呈紅色,呈斑點或長短不一的條紋,即脂質條紋形成,為動脈粥樣硬化早期病變。低、中、高劑量通心絡組及阿托伐他汀組不同程度減少腹主動脈內膜的脂質沉積,高劑量通心絡組腹主動脈內膜脂質沉積明顯減少。

A:正常組;B:模型組;C:低劑量通心絡組;D:中劑量通心絡組;E:高劑量通心絡組;F:阿托伐他汀組圖1 各組腹主動脈(油紅染色)

2.2頸動脈壁MBF變化 模型組頸動脈管壁血流量MBF較正常組顯著升高(P<0.01),與模型組比較,通心絡各劑量組和阿托伐他汀組不同程度降低,以高、中劑量通心絡組和阿托伐他汀組降低明顯(P<0.05,P<0.01),高劑量通心絡組較阿托伐他汀組顯著降低(P<0.01)。見表1。

表1 各組MVD、VEGF、MBF比較

2.3頸動脈外膜微血管新生 VEGF陽性物為棕黃色顆粒狀,主要位于細胞質及細胞外間質中。正常組頸動脈組織內膜、中膜及外膜均可見VEGF少量陽性表達;模型組VEGF在血管各層的陽性表達明顯增多,以外膜微血管內皮細胞及周邊部位表達陽性;低、中、高劑量通心絡組和阿托伐他汀組VEGF陽性表達不同程度上減少。模型組VEGF陽性表達率顯著高于正常組(P<0.01),與模型組比較,高、中劑量通心絡組和阿托伐他汀干預后,外膜VEGF陽性表達率明顯降低(P<0.05,P<0.01),以高劑量通心絡組降低最為顯著(P<0.01),高、中劑量通心絡組和阿托伐他汀組組間比較均無統計學差異(P>0.05)。

正常組頸動脈可見位于頸動脈外膜CD31標記的少量微血管。模型組血管外膜微血管數量明顯增多,中膜未見CD31標記的微血管。通心絡各劑量組和阿托伐他汀組外膜微血管數量不同程度減少,以高、中劑量通心絡組和阿托伐他汀組外膜微血管數量減少較為明顯。管壁MVD定量分析顯示,模型組MVD陽性標記指數較正常組顯著升高(P<0.01),高、中劑量通心絡組和阿托伐他汀組MVD陽性標記指數較模型組顯著降低(P<0.01),通心絡高劑量組較阿托伐他汀組MVD陽性標記指數降低明顯(P<0.05)。見表1、圖2。

圖2 免疫熒光標記TH、NGF、NPY在各組兔頸動脈壁表達(×200)

2.4免疫熒光結果 正常組TH陽性標記的交感神經分布在動脈內膜和中膜-外膜交界區域,模型組外膜微血管周圍TH表達顯著,通心絡各劑量組外膜微血管周圍TH表達不同程度減弱。免疫熒光顯示NGF、NPY在頸動脈管壁的定位及表達,模型組外膜微血管周圍NGF和NPY陽性表達明顯增多,通心絡各劑量組外膜區域NGF、NPY的陽性表達不同程度下降。見圖2。

3 討 論

本研究發現,通心絡在一定程度上抑制高脂血癥兔頸動脈外膜抑制外膜微血管新生,下調VEGF和CD34陽性表達,減少微血管血流量,及抑制血管外膜神經內分泌因子NGF及NPY的表達。因此推測高脂血癥兔頸動脈外膜微血管的新生,可能與降低外膜神經內分泌因子表達有關。

新生內膜形成或內膜增生是動脈粥樣硬化和再狹窄的重要病理標志,與外膜滋養血管有關。外膜血管新生被認為是斑塊不穩定的因素,促進了新生內膜形成。實驗數據顯示,長期應用血管新生抑制劑,可以抑制動脈粥樣硬化病變進展〔19〕。其他數據證明了血管新生的程度與斑塊大小的相關性。血管新生是促血管新生因子與抗血管生成因子相互作用的結果。VEGF是血管新生的主要調節因子,VEGF治療明顯增強了斑塊的發展〔20〕。血管新生作為一種代償機制,會重新分配動脈壁微血管血流量。本研究采用彩色微球檢測了頸動脈壁微血管血流量變化,研究數據顯示外膜血管新生驅動滋養血管的血流量的增加,通心絡降低了動脈壁微血管血流量。微血管血流量的減少可能潛在減輕了新生內膜增生,滋養血管新生在新生內膜形成的作用,可以在之前的研究中得到證明〔21〕。

交感神經似乎一定程度上刺激了外膜微血管新生,TH免疫熒光顯示滋養血管周圍存在交感神經末梢,提示交感神經與外膜血管新生可能具有一定聯系。模型組外膜微血管新生最顯著,而NPY、NGF的表達也最明顯,通心絡各劑量治療組NPY、NGF表達不同程度下降。頸動脈外膜區域存在著交感神經末梢,因此推測在外膜神經末梢釋放神經內分泌因子會刺激微血管的新生。通心絡膠囊具有益氣活血,化瘀通絡止痛的功效,方中人參味甘微苦,性溫,補益心氣,使氣旺血行,為君藥;水蛭活血化瘀,通經透絡;土鱉蟲逐瘀通絡;全蟲、蜈蚣、蟬蛻蟲類藥,善于走竄解痙,引諸藥通經透絡,共為臣藥,現代醫學研究顯示蜈蚣、全蝎等蟲類藥與調節神經內分泌密切相關〔22～24〕;赤芍活血化瘀止痛;冰片芳香走散,疏通經絡,共為佐使藥。因此推測通心絡抑制外膜微血管新生可能與通過影響調節下調神經內分泌因子表達相關,尚需后續深入研究。