lncRNA GATA3-AS1通過靶向miR-361-3p調控T細胞淋巴瘤細胞增殖、遷移和侵襲

王璐 董榮榮 孫士營 王玉萍

(1山東大學齊魯醫院(青島)皮膚科,山東 青島 266035;2青島市婦女兒童醫院檢驗科;3山東大學齊魯醫院(青島)檢驗醫學中心)

淋巴瘤根據形態和免疫組化可將其分為霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤。非霍奇金淋巴瘤來源于B、T和自然殺傷NK淋巴細胞,包括懶惰型和侵襲型〔1〕。T細胞淋巴瘤是一種侵襲性惡性腫瘤,占非霍奇金淋巴瘤的12%～15%,多發生于中老年人。目前,由于T細胞淋巴瘤的化療藥物敏感性低、復發率高等不利因素,患者的治療效果和預后仍不理想〔2〕。因此,亟待尋找有效的治療手段。長非編碼RNA(lncRNAs)是指長度超過200個核苷酸且不具有編碼蛋白功能的轉錄本,研究發現,lncRNAs與人類多種惡性腫瘤進展密切相關。lncRNA GATA結合蛋白3反義RNA(GATA3-AS)1首次發現于人類CD4+T細胞亞群〔3〕。lncRNA GATA3-AS1在三陰性乳腺癌組織和細胞中高表達,敲除lncRNA GATA3-AS1可抑制三陰性乳腺癌細胞生長,并增強免疫應答的抵抗力,lncRNA GATA3-AS1通過穩定程序性細胞死亡-配體(PD-L)1蛋白和降解GATA3蛋白來促進三陰性乳腺癌進展和免疫逃〔4〕。lncRNA GATA3-AS1在肝癌中高表達與腫瘤大小、分期、轉移及患者總生存期縮短顯著相關,lncRNA GATA3-AS1通過抑制磷酸酯酶與張力蛋白同源物(PTEN)、細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑(CDKN)1A和TP53表達促進肝癌細胞增殖和轉移〔5〕。在胰腺癌組織和細胞中,lncRNA GATA3-AS1表達上調,敲除lncRNA GATA3-AS1通過miR-30b-5p/Tex10軸抑制胰腺癌細胞的增殖、侵襲和致瘤能力,并促進細胞凋亡〔6〕。然而lncRNA GATA3-AS1在淋巴瘤中的表達及作用尚不清楚,本實驗通過StarBase預測發現lncRNA GATA3-AS1與miR-361-3p具有結合位點。研究報道,miR-361-3p在淋巴瘤細胞中表達下調,過表達miR-361-3p通過Wnt/β-Catenin信號通路抑制細胞的增殖和遷移,促進凋亡〔7〕。盡管miR-361-3p在淋巴瘤中的作用已有報道,但lncRNA GATA3-AS1在淋巴瘤中的作用及其分子機制是否與miR-361-3p有關還尚未可知。本文對LncRNA GATA-AS1通過靶向miR-361-3p調控T細胞淋巴瘤細胞的增殖、遷移和侵襲展開研究。

1 材料與方法

1.1臨床資料 選取山東大學齊魯醫院2017年6月至2019年6月收治并手術切除的30例T細胞淋巴瘤組織及其癌旁組織樣本,并保存于-80 ℃冰箱,患者均知情同意,本研究經醫院倫理委員會批準。

1.2細胞與試劑 人T淋巴細胞H9和T細胞淋巴瘤細胞Jurkat、人急性淋巴細胞白血病T淋巴細胞(CCRF-CEM)和人淋巴母細胞淋巴瘤細胞(SUP-T1)購自中國典型培養物保藏中心;胎牛血清、RPMI1640培養基購自美國Gibco公司;Trizol試劑、qRT-聚合酶鏈反應(PCR)、反轉錄試劑盒購自北京天根生化科技有限公司;四甲基偶氮唑藍(MTT)試劑盒購自上海晶抗生物工程有限公司;Transwell小室購于美國密理博公司;放射免疫沉淀(RIPA)蛋白裂解液、二辛可寧酸(BCA)、雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒購自北京百奧萊博科技有限公司;Lipofectamine2000購自美國Invitrogen公司;si-NC、si-GATA3-AS1、miR-NC、miR-361-3p、anti-miR-NC、anti-miR-361-3p購自上海吉瑪制藥公司;pcDNA、pcDNA-GATA3-AS1購自上海索寶生物科技有限公司。

1.3細胞轉染與分組 將si-NC、si-GATA3-AS1、miR-NC、miR-361-3p分別轉染至Jurkat細胞,記為si-NC組、si-GATA3-AS1組、miR-NC組、miR-361-3p組;共轉染si-GATA3-AS1和anti-miR-NC、si-GATA3-AS1和anti-miR-361-3p至Jurkat細胞,記為si-GATA3-AS1+anti-miR-NC組、si-GATA3-AS1+anti-miR-361-3p組。

1.4RT-qPCR 提取細胞總RNA,反轉錄成cDNA,lncRNA GATA3-AS1、miR-361-3p分別以磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)和U6為內參,相對表達量采用2-△△Ct法計算。lncRNA GATA3-AS1上游引物:5′-AAGTTGAGCGGGGTATGT-3′,下游:5′-TTTCTGGCCTTTGGTGTC-3′;miR-361-3p上游引物:5′-CTGCACTCCCCCACCTG-3′,下游:5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′;GAPDH上游引物:5′-AGAACGGGAAGCTTGTCATC-3′,下游:5′-CATCGCCCCACTTGATTTTG-3′;U6上游引物:5′-TGCGGGTGCTCGCTTCGGCAGC-3′,下游:5′-CCAGTGCAGGGTCCGAGGT-3′。引物由上海生工生物工程公司合成。

1.5MTT 將各組Jurkat細胞以2.5×104個/ml接種于96孔板(100 μl/孔),培養48 h后,加入20 μl/孔MTT,培養4 h,棄上清,加入150 μl/孔二甲基亞砜(DMSO),室溫震蕩孵育5 min,酶標儀檢測450 nm處的光密度(OD)值。

1.6Transwell 將各組Jurkat細胞接種于Transwell小室上室(5×104個/孔),下室加入含10%胎牛血清的600 μl培養液,在37 ℃下孵育24 h后,用棉簽擦去未穿膜的細胞。多聚甲醛固定,0.1%結晶紫染液染色。置于顯微鏡下計數。

1.7Western印跡提取各組細胞總蛋白,BCA試劑盒定量。各組上樣量60 μg,十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)后轉至聚偏氟乙烯(PVDF)上,5%脫脂牛奶封閉,一抗4 ℃孵育過夜,加入二抗孵育2 h,顯影,定影,Image J軟件分析目的蛋白的相對表達量。

1.8統計學處理 采用SPSS21.0軟件進行獨立樣本t檢驗、單因素方差分析。

2 結 果

2.1lncRNA GATA3-AS1和miR-361-3p在T細胞淋巴瘤組織中的表達 與癌旁組織比較,T細胞淋巴瘤組織lncRNA GATA3-AS1表達水平(1.00±0.16 vs 4.15±0.52)顯著升高,miR-361-3p表達水平顯著降低(1.00±0.12 vs 0.49±0.06,P<0.05);與人T淋巴細胞H9組比較,T細胞淋巴瘤細胞Jurkat、CCRF-CEM和SUP-T1組中lncRNA GATA3-AS1表達水平顯著升高,miR-361-3p組表達水平顯著降低(P<0.05)。見表1。

表1 lncRNA GATA3-AS1和miR-361-3p在T細胞淋巴瘤細胞中的表達

2.2干擾lncRNA GATA3-AS1表達對T細胞淋巴瘤Jurkat細胞增殖、遷移和侵襲的影響 與si-NC組比較,si-GATA3-AS1組OD值、遷移、侵襲細胞數及GATA3-AS1、細胞周期蛋白(Cyclin)D1、基質金屬蛋白酶(MMP)-2、MMP-9表達水平顯著降低,p21表達水平顯著升高(P<0.05)。見表2、圖1、圖2。

1～6:si-NC組、si-GATA3-AS1組、miR-NC組、miR-361-3p組、si-GATA3-AS1+anti-miR-NC組、si-GATA3-AS1+anti-miR-361-3p組,下圖同圖1 各組T細胞淋巴瘤Jurkat細胞遷移和侵襲(結晶紫染色,×200)

圖2 各組T細胞淋巴瘤Jurkat細胞增殖、遷移和侵襲相關蛋白表達

表2 干擾lncRNA GATA3-AS1表達對T細胞淋巴瘤Jurkat細胞增殖、遷移和侵襲的影響

2.3lncRNA GATA3-AS1靶向調控miR-361-3p表達 StarBase預測顯示lncRNA GATA3-AS1序列含有與miR-361-3p互補的核苷酸序列。見圖3。與轉染miR-NC的WT-GATA3-AS1比較,轉染miR-361-3p熒光素酶活性顯著降低(P<0.05)。與pcDNA組miR-361-3p表達(1.01±0.12)比較,pcDNA-GATA3-AS1組(0.42±0.03)顯著降低(P<0.05);與si-NC組miR-361-3p表達(1.00±0.08)比較,si-GATA3-AS1組(2.93±0.39)顯著升高(P<0.05)。lncRNA GATA3-AS1靶向負調控miR-361-3p表達(P<0.05)。見圖1、表3。

圖3 GATA3-AS1與miR-361-3p的互補核苷酸序列

表3 雙熒光素酶報告實驗

2.4過表達miR-361-3p對T細胞淋巴瘤Jurkat細胞增殖、遷移和侵襲的影響 與miR-NC組比較,miR-361-3p組miR-361-3p及p21表達顯著升高,OD值、遷移、侵襲細胞數及CyclinD1、MMP-2、MMP-9表達顯著降低(均P<0.05)。見圖1、圖2、表4。

表4 過表達miR-361-3p對T細胞淋巴瘤Jurkat細胞增殖、遷移和侵襲的影響

2.5下調miR-361-3p逆轉干擾lncRNA GATA3-AS1表達對T細胞淋巴瘤Jurkat細胞增殖、遷移和侵襲的影響 與si-GATA3-AS1+anti-miR-NC組比較,si-GATA3-AS1+anti-miR-361-3p組miR-361-3p及p21表達水平顯著降低,OD值、遷移、侵襲細胞數及CyclinD1、MMP-2、MMP-9表達水平顯著升高(P<0.05)。見圖1、圖2、表5。

表5 下調miR-361-3p逆轉干擾lncRNA GATA3-AS1表達對T細胞淋巴瘤Jurkat細胞增殖、遷移和侵襲的影響

3 討 論

lncRNAs的異常表達與淋巴瘤的發生和發展密切相關。在體內外實驗中,過表達lncRNA TCLlnc1促進T細胞淋巴瘤細胞的增殖和遷移〔8〕。LINC01013在間變性大細胞淋巴瘤組織中表達上調,敲除LINC01013抑制侵襲性間變性大細胞淋巴瘤細胞的侵襲〔9〕。在結外自然殺傷/T細胞淋巴瘤組織和細胞中,lncRNA XIST表達顯著增加,敲除lncRNA XIST通過miR-497/B細胞淋巴瘤(Bcl)-w軸抑制結外自然殺傷/T細胞淋巴瘤細胞的增殖和遷移〔10〕。在彌漫性大B細胞淋巴瘤組織中,lncRNA MALAT1表達上調,敲減lncRNA MALAT1通過miR-195/PD-L1軸抑制OCI-Ly10細胞增殖、遷移、上皮間質轉化(EMT)和免疫逃逸能力,并促進細胞凋亡〔11〕。LINC00908在彌漫性大B細胞淋巴瘤組織和細胞中表達顯著上調,下調LINC00908通過靶向上調miR-671-5p抑制彌漫性大B細胞淋巴瘤細胞的增殖和侵襲〔12〕。lncRNA PCAT1在彌漫性大B細胞淋巴瘤組織和細胞系中表達上調,其高表達與患者的臨床分期及淋巴瘤國際預后評分(IPI)評分有關,lncRNA PCAT1通過miR-508-3p/核因子(NF)IB軸促進彌漫性大B細胞淋巴瘤細胞的增殖、遷移和侵襲〔13〕。與上述研究結果一致,本實驗結果提示,干擾lncRNA GATA3-AS1表達可降低Jurkat細胞的增殖、遷移和侵襲能力。

研究表明,lncRNAs可作為競爭性內源RNA負調控相關miRNA表達來調節淋巴癌進展〔10～13〕。miR-361-3p在人類多種癌癥中發揮抑癌基因作用,如miR-361-3p在骨髓瘤細胞中低表達,上調miR-361-3p通過靶向腫瘤壞死因子受體相關因子(TRAF)6誘導骨髓瘤細胞凋亡,并抑制細胞增殖〔14〕。miR-361-3p在復發性前列腺癌患者中低表達,過表達miR-361-3p可通過抑制ARv7和MAP激酶結合絲氨酸/蘇氨酸激酶(MKNK)2表達提高前列腺癌細胞的恩扎魯胺敏感性〔15〕。在宮頸癌組織和細胞中,CircUBAP2 表達上調,下調miR-361-3p可部分逆轉敲減CircUBAP2表達對宮頸癌細胞生長和轉移的抑制作用〔16〕。circ_0075960通過調控miR-361-3p/SH2B1軸促進子宮內膜癌進展〔17〕。敲減circ_0011385通過上調miR-361-3p抑制甲狀腺癌細胞的增殖、遷移和侵襲,并促進細胞周期阻滯和凋亡〔18〕。miR-361-3p在非小細胞肺癌組織和細胞中表達顯著降低,其低表達與淋巴結轉移和TNM分期密切相關,抑制miR-361-3p表達通過靶向上調SH2B1促進非小細胞肺癌細胞的生長、增殖、集落形成、侵襲和遷移〔19〕。與上述研究結果一致,本實驗結果提示,過表達miR-361-3p可降低Jurkat細胞的增殖、遷移和侵襲能力,且下調miR-361-3p逆轉了干擾lncRNA GATA3-AS1表達對Jurkat細胞增殖、遷移和侵襲的影響。