橄欖苦苷抑制胃癌AGS細胞增殖、遷移和侵襲

周鑫 谷建海

(臨沂市腫瘤醫院藥學部,山東 臨沂 276001)

近年來,胃癌已成為我國最常見的消化道惡性腫瘤之一。由于缺乏臨床癥狀多數患者診斷為晚期,化療是胃癌晚期患者的主要治療段,但往往產生骨髓抑制、肝腎功能損害、胃腸道反應等毒副作用〔1〕。因此,尋找新的治療藥物已成為醫務工作者亟待解決的問題。橄欖苦苷作為橄欖油、橄欖葉等橄欖產品的主要生物酚成分,是公認的抗氧化劑。橄欖苦苷通過誘導細胞凋亡、抑制細胞增殖和腫瘤形成、逆轉放療抵抗在乳腺癌、前列腺癌、黑色素瘤、卵巢癌等腫瘤中具有抗癌活性〔2～5〕。有報道稱,橄欖苦苷磁性納米顆粒還可抑制胃癌細胞增殖,是預防和治療胃腺癌的潛在藥物〔6〕。微小RNA(miRNA)可作為治療人類疾病的潛在藥物靶點。既往研究報道,非小細胞肺癌中miR-4792表達降低,上調其表達具有誘導癌細胞凋亡,抑制癌細胞遷移和侵襲等生物學活性〔7〕。此外,miR-4792通過靶向叉頭框基因(FOX)C1能夠抑制鼻咽癌上皮間質轉化(EMT)和侵襲〔8〕。但miR-4792在胃癌中是否發揮抗癌作用并不清楚。本研究旨在分析不同濃度橄欖苦苷對胃癌細胞增殖、遷移、侵襲的影響,并探討其是否通過調控miR-4792表達發揮作用。

1 材料與方法

1.1細胞和試劑 胃癌細胞AGS購于中國科學院上海細胞庫;橄欖苦苷(純度≥98%)購于四川省維克奇生物科技有限公司;細胞計數試劑盒(CCK-8)、總蛋白提取試劑盒購自上海貝博生物公司;康寧24-Transwell小室購自南京迅貝生物科技有限公司;上皮型鈣黏蛋白(E-cadherin)兔多克隆抗體、神經型鈣黏蛋白(N-cadherin)兔單克隆抗體、磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)兔單克隆抗體、山羊抗兔IgG二抗購自北京義翹神州科技股份公司;Lipofectamine2000、cDNA合成試劑盒購自美國Invitrogen公司;SYBR Premix Ex Taq購自日本TaKaRa公司;miR-4792模擬物(mimics)、抑制物(anti-miR-4792)及相應對照(miR-NC、anti-miR-NC)購自上海生工生物公司。

1.2方法

1.2.1橄欖苦苷對AGS細胞增殖的影響 分別采用含0、100、200、400 μg/ml橄欖苦苷〔9〕的杜爾伯格伊戈爾培養基(DMEM)置于37 ℃、含5%CO2、飽和濕度培養箱孵育AGS細胞,依次標記為對照組、橄欖苦苷低劑量組、橄欖苦苷中劑量組、橄欖苦苷高劑量組。孵育48 h后,收集5×102個細胞均勻鋪6孔板,培養箱內孵育10～12 d。甲醇固定細胞集落,0.5%結晶紫染色20 min。以顯微鏡下大于50個細胞的集落為有效克隆數。每組設置3個復孔,實驗獨立重復9次。同時將5×103個AGS細胞接種96孔板,加入含對應劑量橄欖苦苷的DMEM培養液富于細胞48 h,更換為新鮮培養液,向各孔添加CCK-8溶液(10 μl/孔)孵育細胞2 h。設置450 nm波長,酶標儀測量各孔光密度(OD)。增殖抑制率=(A對照組-A實驗組)/(A對照組-A空白組)×100%。每組設置3個復孔,實驗獨立重復9次。

1.2.2橄欖苦苷對AGS細胞遷移的影響 將1×104個橄欖苦苷處理48 h的AGS細胞接種6孔板,當細胞生長至一層時,用200 μl槍頭尖端在細胞表面劃一直線。用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌去除細胞碎片。在劃痕0 h、培養24 h后用Image軟件確定創面寬度。劃痕愈合率=〔寬度(0 h)-寬度(24 h)〕/寬度(0 h)×100%。每組設置3個復孔,實驗獨立重復9次。

1.2.3橄欖苦苷對AGS細胞侵襲的影響 采用包被80 μl基質膠的24-Transwell小室(0.8 mg/ml)進行侵襲實驗。收集橄欖苦苷處理48 h的AGS細胞,用胰蛋白酶消化細胞,用無血清DMEM培養基重懸細胞。Transwell小室接種200 μl約2×104個懸浮細胞,下腔接種600 μl含10%血清培養基。常規孵育24 h,4%多聚甲醛室溫固定Transwell膜下表面15 min,PBS洗2次,0.5%結晶紫染色30 min。在倒置顯微鏡下隨機選擇3個視野對染色的侵襲性細胞拍照,以平均值表示AGS細胞侵襲數量。每組設置3個復孔,實驗獨立重復9次。

1.2.4橄欖苦苷對AGS細胞miR-4792表達的影響 使用Trizol試劑從對照組、橄欖苦苷處理組細胞中提取總RNA。采用cDNA合成試劑盒獲得cDNA,然后SYBR Premix Ex Taq進行實時定量PCR(RT-qPCR)。內源對照為U6。PCR參數為:95 ℃ 10 min,95 ℃ 5 s,55 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s,40個循環。PCR循環結束后,進行熔解曲線分析。AGS細胞中miR-4792的相對表達水平以2-ΔΔCt法計算。每組設置3個復孔,實驗獨立重復9次。

1.2.5橄欖苦苷對AGS細胞E-cadherin和N-cadherin蛋白表達的影響 總蛋白提取試劑盒分離橄欖苦苷處理組AGS細胞總蛋白,用二喹啉甲酸(BCA)試劑盒進行定量。蛋白樣品用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離后,轉移蛋白至聚偏氟乙烯膜,5%脫脂牛奶封閉后,然后對膜進行免疫檢測。采用1∶1 000稀釋的E-cadherin一抗、N-cadherin一抗、內參GAPDH一抗室溫孵育膜2 h。再用1∶1 000稀釋山羊抗兔IgG二抗室溫孵育膜1 h。滴加化學發光檢測試劑進行顯色。Quantify One軟件分析測定目的蛋白條帶相對灰度值。每組設置3個復孔,實驗獨立重復9次。

1.2.6細胞轉染 將2×105個對數期AGS細胞在6孔板中培養,按照Lipofectamine2000說明分別轉染miR-NC、miR-4792 mimics、anti-miR-NC、anti-miR-4792至60%匯合AGS細胞,隨后收集轉染48 h細胞。轉染miR-NC、轉染miR-4792 mimics的AGS細胞記為miR-NC組、miR-4792組。用含400 μg/ml橄欖苦苷的DMEM培養液孵育轉染anti-miR-NC或者轉染anti-miR-4792細胞48 h,記為橄欖苦苷+anti-miR-NC組、橄欖苦苷+anti-miR-4792組。

1.2.7過表達miR-4792或者抑制miR-4792表達聯合橄欖苦苷處理對AGS細胞生物學性的影響 收集miR-NC組、miR-4792組、橄欖苦苷+anti-miR-NC組、橄欖苦苷+anti-miR-4792組AGS細胞,按照上述步驟觀察過表達miR-4792或者抑制miR-4792表達聯合橄欖苦苷對AGS細胞生物學行為的影響。每組設置3個復孔,實驗獨立重復9次。

1.3統計學分析 采用SPSS18.0軟件進行t檢驗、方差分析,組間兩兩比較采用SNK-q檢驗。

2 結 果

2.1橄欖苦苷對胃癌AGS細胞增殖的影響 與對照組比較,橄欖苦苷處理組AGS細胞克隆形成個數均顯著下降,增殖抑制率顯著升高(均P<0.05)。見表1、圖1。

表1 橄欖苦苷對胃癌AGS細胞增殖的影響

2.2橄欖苦苷對胃癌AGS細胞遷移和侵襲的影響 與對照組比較,橄欖苦苷處理組AGS細胞N-cadherin蛋白表達量、劃痕愈合率、侵襲數量顯著降低,E-cadherin蛋白表達量顯著升高(均P<0.05)。見圖2、表2、圖3。

圖2 橄欖苦苷對胃癌AGS細胞遷移(×200)、侵襲(結晶紫染色,×400)及形態(×200)的影響

1～4:對照組、橄欖苦苷低劑量組、橄欖苦苷中劑量組、橄欖苦苷高劑量組圖3 Western印跡檢測E-cadherin、N-cadherin蛋白表達

圖4 miR-4792過表達對胃癌AGS細胞E-cadherin和N-cadherin蛋白表達的影響

圖5 miR-4792過表達對胃癌AGS細胞克隆形成的影響(結晶紫染色,×20)

圖6 miR-4792過表達對胃癌AGS細胞遷移(×200)、侵襲(結晶紫染色,×400)及形態(×200)的影響

表2 橄欖苦苷對胃癌AGS細胞遷移、侵襲及miR-4792表達的影響

2.3橄欖苦苷對胃癌AGS細胞miR-4792表達的影響 與對照組比較,橄欖苦苷處理組AGS細胞miR-4792表達量顯著升高(P<0.05)。見表2。

2.4miR-4792過表達對胃癌AGS細胞增殖、遷移和侵襲的影響 與miR-NC組比較,miR-4792組AGS細胞miR-4792表達顯著升高(P<0.05),提示miR-4792過表達的AGS細胞株構建成功。與miR-NC組比較,miR-4792組AGS細胞克隆形成個數、劃痕愈合率、侵襲細胞數量、N-cadherin蛋白表達量顯著下降,而增殖抑制率、E-cadherin蛋白表達顯著升高(均P<0.05)。見圖4～6、表3。

表3 miR-4792過表達對胃癌AGS細胞增殖、遷移和侵襲的影響

2.5抑制miR-4792表達逆轉了橄欖苦苷(400 μg/ml)對胃癌AGS細胞增殖、遷移侵襲的影響 與橄欖苦苷+anti-miR-NC組比較,橄欖苦苷+anti-miR-4792組AGS細胞miR-4792表達量顯著降低,細胞克隆形成個數、劃痕愈合率、侵襲細胞數量、N-cadherin蛋白表達量顯著升高,而增殖抑制率、E-cadherin蛋白表達量顯著降低(均P<0.05)。見圖7～圖9、表4。

1,2:橄欖甘苷+anti-miR-NC組、橄欖苦苷+anti-miR-4792組圖7 抑制miR-4792表達逆轉了橄欖苦苷對胃癌AGS細胞E-cadherin和N-cadherin蛋白表達的影響

圖8 抑制miR-4792表達逆轉了橄欖苦苷對胃癌AGS細胞克隆形成的影響(結晶紫染色,×20)

圖9 抑制miR-4792表達逆轉了橄欖苦苷對胃癌AGS細胞遷移(×200)、侵襲(結晶紫染色,×400)及形態(×200)的影響

表4 抑制miR-4792表達逆轉了橄欖苦苷對胃癌AGS細胞增殖、遷移侵襲的影響

3 討 論

橄欖苦苷在多種人類癌癥中顯示出抗腫瘤特性。Zhang等〔10〕研究表明,橄欖苦苷在體外對食管癌細胞增殖、遷移和侵襲具有抑制作用,并抑制體內異種移植瘤形成。Liu等〔11〕證實橄欖苦苷可消除核因子(NF)-κB激活級聯反應,進而誘導乳腺癌細胞大量凋亡。此外,Lu等〔12〕發現橄欖苦苷可能通過激活自噬來抑制三陰性乳腺癌細胞的遷移和侵襲。本研究提示橄欖苦苷對胃癌細胞惡性生物學行為具有抑制作用。有數據表明,EMT與癌細胞的遷移、侵襲及癌癥轉移、復發有關〔13〕。在EMT過程中,上皮標志物E-cadherin表達下調,間質標志物N-cadherin表達上調〔14〕。本研究結果表明,橄欖苦苷可能通過抑制EMT進而抑制胃癌細胞遷移和侵襲。

miRNA表達失調可影響細胞的發育、分化、增殖、凋亡,參與腫瘤的發生和進展。前期研究發現,在乳腺癌中橄欖苦苷通過下調致癌基因miR-21和miR-155的表達來誘導乳腺癌細胞凋亡,抑制乳腺癌細胞遷移和侵襲〔15,16〕。橄欖苦苷在體外和體內均能增強鼻咽癌細胞的放射敏感性,其機制與抑制氧誘導因子(HIF)-1α誘導的miR-519d表達有關〔17〕。此外,橄欖苦苷通過調控Let-7d表達對膠質瘤細胞表現出抗癌作用〔18〕。本研究結果提示,橄欖苦苷在胃癌中的抗腫瘤作用可能與上調miR-4792有關。據報道,miR-4792在非小細胞肺癌、鼻咽癌、急性髓性白血病中起著抑癌作用,miR-4792通過靶向Kindlin-3抑制急性髓系白血病細胞增殖和侵襲,促進細胞凋亡〔7,8,19〕。本研究結果說明,橄欖苦苷對胃癌細胞AGS增殖、遷移和侵襲的抑制作用可能是通過上調miR-4792表達實現的。