下調lncRNA DSCAM-AS1表達通過負調控miR-338-3p抑制結直腸癌細胞增殖、侵襲和遷移的機制

袁泉良 郭躍 張慶東

(南陽市中心醫院肛腸科,河南 南陽 473009)

結直腸癌是常見的消化道腫瘤,發病率和病死率均居全球前三,易轉移,臨床治療仍以放化療為主,靶向治療逐漸成為新的治療方式〔1〕。對其分子機制的研究不僅有助于預測腫瘤進展或轉移復發風險、判斷預后,還利于精準化治療。長鏈非編碼RNA(lncRNA)屬于一種基因表達網絡RNA,與調節表觀遺傳轉錄和轉錄后水平關系密切,長度超過200 nt但不能編碼蛋白質,何祖坤等〔2〕發現其在結直腸癌的發生發展中具有調控作用,在結直腸癌中表達異常,可作為預后和診斷的新型潛在生物標志物及治療靶點。DSCAM-AS1是一種乳腺癌異性和雌激素受體α依賴性長非編碼RNA,其沉默會導致乳腺癌遷移和侵襲性降低〔3〕,但其對結直腸癌細胞的影響尚未清楚。miRNAs也是一類保守非編碼RNA,與結直腸癌的發生、侵襲及轉移等密切相關,可通過不同的信號途徑調控其靶基因進而參與結直腸癌的發生發展〔4〕。 研究發現miR-338-3p通過下調新型轉化生長因子-β1型受體激酶(ALK)5抑制腎細胞癌的侵襲〔5〕;miR-338-3p抑制肝細胞癌細胞的上皮-間質轉化和轉移〔6〕。miR-338-3p在結直腸癌細胞中低表達,過表達可抑制腫瘤細胞侵襲轉移〔7〕,還能抑制結直腸癌細胞增殖,促進細胞凋亡〔8〕。但DSCAM-AS1是否通過調控miR-338-3p影響結直腸癌的進展尚不清楚,本文旨在研究lncRNA DSCAM-AS1對結直腸癌增殖、遷移和侵襲的影響及其是否與miR-338-3p有關,為診斷治療結直腸癌提供新靶點和新思路。

1 材料與方法

1.1材料與試劑 中國科學院上海細胞庫結直腸癌細胞株SW1116、HT29、SW480和正常結直黏膜上皮細胞NCM460;RIPA蛋白裂解液和十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)試劑盒(上海碧云天生物技術有限公司);基質膠、Transwell小室(美國BD公司);雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒(北京Solarbio公司);噻唑藍(MTT)試劑盒、二甲基亞砜(DMSO)、二喹啉甲酸(BCA)試劑盒(Sigma公司);LipofectamineTM2000轉染試劑(美國Invitrogen公司);Trizol試劑、反轉錄試劑盒、熒光定量試劑盒(日本TaKaRa公司);胰蛋白酶、RPMI1640培養基、胎牛血清(美國Gibico公司)。

1.2細胞培養 結直腸癌細胞株SW480、SW1116、HT29和正常結直黏膜上皮細胞NCM460采用10%胎牛血清的RPMI1640培養基培養,培養條件為飽和濕度、5% CO2、37 ℃,換液1次/d,將胰蛋白酶加入培養基消化傳代,加入時機為80%左右的細胞融和度,選取實驗細胞標準為處于對數生長期。

1.3細胞轉染與分組 按照LipofectamineTM2000試劑盒進行轉染操作。0.25%胰蛋白酶消化常規培養的結直腸癌細胞SW480后接種于96孔板中,更換為無血清培養基,更換時機為80%左右的細胞融和度,同步化12 h進行轉染。轉染分為miR-NC組(轉染miR-NC)、miR-338-3p組(轉染miR-338-3p mimics)、si-NC組(轉染si-NC)、si-DSCAM-AS1組(轉染si-DSCAM-AS1)、pcDNA組(轉染pcDNA)、pcDNA-DSCAM-AS1組(轉染pcDNA-DSCAM-AS1)、si-DSCAM1-AS1+anti-miR-NC組(共轉染si-DSCAM-AS1和anti-miR-NC)、si-DSCAM-AS1+anti-miR-338-3p組(共轉染anti-miR-338-3p和si-DSCAM-AS1)。

1.4qRT-聚合酶鏈反應(PCR)檢測DSCAM-AS1 mRNA和miR-338-3p表達水平 在Trizol試劑中加入研磨充分的各組細胞并提取總RNA,RNA濃度和純度采用微量核酸測定儀檢測。將RNA反轉錄成cDNA,反轉錄使用TaKaRa試劑盒,PCR擴增以磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)為內參,反應體系配制按照TaKaRa 熒光定量試劑盒使用說明,共循環40次,3次重復/樣品,循環條件為95 ℃、72 ℃均30 s,60 ℃ 35 s。相對表達量計算采用2-ΔΔCt法。

1.5Western印跡檢測蛋白表達 BCA試劑盒測定蛋白濃度,各組細胞加入RIPA裂解液,4 ℃離心15 min,12 377 r/min。蛋白樣品SDS-PAGE后轉至聚偏氟乙烯(PVDF)膜,5%脫脂奶粉封閉液室溫封閉1 h。加入一抗(1∶1 000)4 ℃孵育過夜,TBST洗膜;室溫加入二抗(1∶2 000)孵育2 h,Tris鹽酸緩沖液吐溫(TBST)洗滌3次,10 min/次,膠片Quantity One凝膠分析軟件處理,設3個重復于每個蛋白樣品。蛋白表達水平即GAPDH條帶和測定的各組蛋白條帶的吸光度的比值。

1.6MTT檢測細胞增殖 5 g/L的MTT溶液20 μl分別加入培養至24、48、72 h的各組細胞,孵育4 h將多余培養基棄去后加入DMSO 150 μl振蕩反應10 min,酶標儀檢測490 nm處吸光度(OD)值。細胞活性即兩組OD比值。

1.7Transwell檢測細胞遷移和侵襲 濃度2×104個/ml,重懸胰酶消化后的各組細胞采用無血清培養基。細胞遷移實驗:Transwell小室上室中接種細胞懸液200 μl,5% CO2、37 ℃條件下培養于含完全培養基的下室中24 h,去除培養基,取出小室,磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌,棉簽擦去上層細胞,0.1%結晶紫染色10 min,4%多聚甲醛加入后固定30 min,顯微鏡視野隨機拍照5個,結晶紫染色細胞數即遷移細胞數。細胞侵襲實驗:Transwell小室的上室鋪上RPMI1640培養液1∶5比例加入并稀釋的基質膠,操作同細胞遷移實驗。結晶紫染色細胞數即侵襲細胞數。

1.8DSCAM-AS1對miR-338-3p的靶向調控檢測 構建3′編碼區(UTR)-熒光素酶表達載體,突變型和野生型基因靶點DSCAM-AS1(MUT-DSCAM-AS1和WT-DSCAM-AS1),5×104個/孔的24孔板接種對數生長期結腸癌細胞,MUT-DSCAM-AS1和WT-DSCAM-AS1組細胞采用LipofectamineTM2000分別轉染miR-338-3p和miR-NC,轉染時機為80%左右的細胞融和度。雙熒光素酶報告實驗測定使用熒光素酶報告基因檢測儀,依據說明書要求。

1.9統計學方法 采用SPSS25.0軟件行t檢驗和方差分析。

2 結 果

2.1不同細胞中miR-338-3p和DSCAM-AS1 mRNA表達 結直腸癌細胞SW480、HT29、SW1116中DSCAM-AS1 mRNA表達水平與正常結直黏膜上皮細胞NCM460相比顯著升高,miR-338-3p表達水平顯著降低(均P<0.05)。選擇表達變化最明顯的SW480細胞做后續試驗。見表1。

表1 DSCAM-AS1 mRNA和miR-338-3p在不同細胞中的表達

2.2下調DSCAM-AS1 mRNA表達對結直腸癌SW480細胞增殖的影響 qRT-PCR結果顯示,與si-NC組比較,si-DSCAM-AS1組SW480細胞中DSCAM-AS1 mRNA及CyclinD1蛋白表達水平明顯降低,p27、p21蛋白表達水平明顯升高(P<0.05)。MTT法結果顯示,與si-NC組相比,si-DSCAM-AS1組24、48、72 h SW480細胞活性顯著降低(P<0.05)。見表2、圖1。可見,下調DSCAM-AS1表達抑制結直腸癌SW480細胞增殖。

圖1 Western印跡檢測兩組增殖相關蛋白表達

表2 下調DSCAM-AS1 mRNA表達對結直腸癌SW480細胞增殖的影響

2.3DSCAM-AS1表達下調影響結直腸癌SW480細胞侵襲、遷移 Western印跡檢測結果顯示,與si-NC組相比,si-DSCAM-AS1組SW480細胞中基質金屬蛋白酶(MMP)-2、MMP-9、MMP-14蛋白表達水平顯著降低(P<0.05)。Transwell 法檢測結果顯示,與si-NC組相比,si-DSCAM-AS1組SW480細胞中遷移和侵襲數量顯著降低(P<0.05)。見圖2、表3、圖3。

圖2 Western印跡檢測兩組遷移、侵襲相關蛋白表達

圖3 DSCAM-AS1表達下調影響結直腸癌SW480細胞遷移、侵襲(結晶紫染色,×400)

表3 各組結直腸癌SW480細胞遷移、侵襲及相關蛋白比較

2.4miR-338-3p過表達對結直腸癌SW480細胞侵襲、遷移及增殖的影響 與miR-NC組相比,miR-338-3p組SW480細胞侵襲和遷移數量和48、72 h細胞活性及CyclinD1、MMP-2、MMP-9蛋白表達水平顯著降低,miR-338-3p、p21蛋白表達水平顯著升高(均P<0.05)。見圖4、表4。可見,結直腸癌SW480細胞侵襲、遷移和增殖受miR-338-3p過表達抑制。

1～6:miR-NC組、miR-338-3p組、si-NC組、si-DSCAM-AS1組、si-DSCAM-AS1+anti-miR-NC組、si-DSCAM-AS1+anti-miR-338-3p組圖4 Western印跡檢測各組相關侵襲、遷移增殖蛋白表達

表4 結直腸癌SW480細胞侵襲、遷移增殖受miR-338-3p過表達的影響

2.5lncRNA DSCAM-AS1靶向調控miR-338-3p表達 miR-338-3p與DSCAM-AS1存在結合位點通過TargetScan數據庫預測,見圖5。突變型DSCAM-AS1基因表達載體MUT-DSCAM-AS1被轉染后,相較于miR-NC組,miR-338-3p組MUT-DSCAM-AS1結直腸癌SW480細胞的熒光素酶活性差異不顯著(P>0.05)。野生型DSCAM-AS1基因表達載體WT-DSCAM-AS1轉染后,相較于miR-NC組,miR-338-3p組WT-DSCAM-AS1結直腸癌SW480細胞熒光素酶活性顯著降低(P<0.05),見表5。相較于pcDNA組miR-338-3p表達水平(1.02±0.09),pcDNA-DSCAM-AS1組結直腸癌SW480細胞中miR-338-3p表達水平(0.41±0.04)顯著降低(P<0.05)。相較于si-NC組miR-338-3p表達水平(1.00±0.08),si-DSCAM-AS1組結直腸癌SW480細胞中miR-338-3p表達水平(2.91±0.29)顯著升高(P<0.05)。可見,DSCAM-AS1可靶向調控miR-338-3p表達。

圖5 DSCAM-AS1的序列中含有與miR-338-3p互補的核苷酸序列

表5 兩組雙熒光素酶結果比較

2.6抑制miR-338-3p表達逆轉下調DSCAM-AS1表達對SW480細胞增殖遷移侵襲的影響 與si-DSCAM-AS1+anti-miR-NC組相比,si-DSCAM-AS1+anti-miR-338-3p組SW480細胞中miR-338-3p、p21蛋白表達水平顯著降低,MMP-9、MMP-2、CyclinD1蛋白表達水平、細胞遷移和侵襲數量及24、48、72 h細胞活性顯著升高(均P<0.05)。與si-NC組相比,si-DSCAM-AS1組SW480細胞中miR-338-3p p21蛋白表達水平顯著升高,CyclinD1、MMP-2、MMP-9蛋白表達水平、細胞遷移和侵襲數量及48、72 h細胞活性顯著降低(均P<0.05)。見圖4、表6。下調DSCAM-AS1表達對SW480細胞侵襲、遷移、增殖抑制作用逆轉的是抑制miR-338-3p表達。

表6 抑制miR-338-3p表達逆轉下調DSCAM-AS1表達對SW480細胞增殖、遷移侵襲的作用

3 討 論

結直腸癌具有很高的發病率及死亡率,嚴重威脅人類健康〔9〕。越來越多的研究表明lncRNAs在結直腸癌的發生發展中起重要作用,影響結直腸癌細胞的增殖、凋亡、分化、侵襲和轉移等〔10〕。研究發現DSCAM-AS1參與乳腺癌的生物學進程和耐藥性〔11〕;DSCAM-AS1在乳腺癌中上調表達,通過靶向miR-137增強乳腺癌中的他莫昔芬抗性〔12〕。DSCAM-AS1在吸煙者的肺腺癌組織中表達增高,且在香煙提取物處理肺腺癌A549細胞系中表達水平也升高,提示DSCAM-AS1或與吸煙和肺腺癌相關〔13〕。豐雪等〔14〕運用生物信息學分析發現DSCAM-AS1通過細胞信號傳導、細胞新陳代謝、能量相關通路等與肺腺癌的發病有關,可作為肺腺癌潛在的治療靶點。本實驗結果發現,DSCAM-AS1可靶向調控miR-338-3p。研究發現miRNA在結直腸癌患者中表達異常,可靶向結合mRNA,通過沉默癌細胞生長相關基因的表達參與腫瘤進展〔15〕。此外,miRNA還能調控上皮間質轉化影響結直腸癌的侵襲轉移〔16〕。miR-338-3p在肝癌組織和細胞系中下調表達,通過下調FOXP4抑制肝細胞癌細胞增殖〔17〕;miR-338-3p通過靶向鞘氨醇激酶(SphK)2抑制細胞增殖并誘導非小細胞肺癌細胞凋亡〔18〕。

miR-338-3p在結直腸癌中低表達,miR-338-3p通過轉錄后基因沉默機制抑制結腸癌轉移相關基因MACCI表達,從而抑制結直腸癌的發生〔19〕。miR-338-3p還可通過抑制精胺氧化酶(SMO)蛋白的表達從而抑制結直腸癌細胞侵襲轉移〔7〕。miR-338-3p抑制劑能克服p53突變的結腸癌細胞中5-氟尿嘧啶抗性〔20〕。本實驗表明,miR-338-3p被DSCAM-AS1靶向調控,抑制miR-338-3p表達部分逆轉下調DSCAM-AS1對SW480細胞侵襲、遷移和增殖的抑制作用。

綜上,對結直腸癌細胞的侵襲、遷移和增殖有抑制作用的機制可能與靶向調控miR-338-3p有關,結直腸癌的預后判斷、治療及診斷方面lncRNA DSCAM-AS1可提供新靶點。