鼻息肉組織黏蛋白5AC、免疫球蛋白E、白細胞介素-35表達對鼻黏膜上皮細胞凋亡的影響

黃輝 蔣勁松 周明朗 代國勝 冀慶軍 何苗 柴偉 孫敬武

(1亳州市人民醫院耳鼻咽喉頭頸外科,安徽 亳州 236800;2中國科學技術大學附屬第一醫院(安徽省立醫院))

鼻息肉是耳鼻喉科常見疾病,但目前鼻息肉發病原因及機制尚未完全清楚。隨著鼻內鏡及各種醫療科技的不斷進步,治療已不再是難以實現的目標,可是仍有部分患者治療后復發。研究表明,鼻息肉的進展與許多細胞因子有關〔1,2〕。也有研究發現多種慢性炎癥參與鼻息肉發病〔3〕。白細胞介素(IL)-35是一種多源性細胞因子,在炎癥反應中激活血管內皮細胞及白細胞。黏蛋白(MUC)5AC是腺體細胞產生,在呼吸系統中分泌。免疫球蛋白(Ig)E由呼吸道及胃黏膜等層漿細胞產生。目前這三類呼吸道相關因子與鼻息肉發生關系的臨床研究較少。本文探討RNA干擾技術沉默MUC5AC、IgE、IL-35基因對鼻黏膜上皮細胞凋亡的影響及機制。

1 材料與方法

1.1一般材料 收集亳州市人民醫院2019年6月至2020年7月手術切除后存檔的慢性鼻竇炎鼻息肉組織石蠟包埋標本40例,其中男27例,女13例,年齡31～71歲,平均(52.33±10.41)歲。納入標準:(1)首次鼻息肉摘除術者;(2)術前2 d未使用激素藥物治療;(3)簽署知情同意書。排除標準:(1)精神異常者;(2)鼻內真菌感染者;(3)支氣管哮喘者;(4)嚴重系統疾病者。選擇正常下鼻甲組織對照組,其中男16例,女12例,年齡35～72歲,平均(51.04±10.37)歲。兩組一般資料差異無統計學意義(P>0.05),具有可比性。本研究通過醫院倫理委員會批準,符合道德倫理要求。

1.2材料和儀器 胰蛋白酶購自杭州昕誠生物科技有限公司;細胞培養基、磷酸鹽緩沖液(PBS)購自廣州捷威斯生物科技有限公司;二喹啉甲酸(BCA)蛋白濃度測定試劑盒購自信裕生物(上海)公司;MUC5AC、IgE、IL-35、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(caspase)3單克隆抗體的二抗均購于美國Abcam;細胞凋亡試劑盒購于ACTGene公司;酶標儀購于北京沃格東方科技有限公司;流式細胞儀購自廣州泰勒生物科技有限公司;CO2細胞培養箱購自綿陽榮盛科技公司。特異性siRNA設計由上海閃晶生物科技公司合成。

1.3MUC5AC、IgE、IL-35表達檢測 將鼻息肉組織及下鼻甲組織研磨,加入裂解液,在冰塊上靜置1 h,設定12 000 r/min離心20 min,取出上清液。根據試劑盒操作說明檢測MUC5AC、IgE、IL-35的蛋白濃度。依次變性、電泳,凝膠,轉膜,封閉。加入一抗,4 ℃孵育過夜,TBST緩沖液洗膜后加入羊抗鼠IgG,37 ℃孵育2 h。TBST清洗后加入電化學發光法(ECL)發光劑顯影,凝膠成像。選定β-actin為內參,分析蛋白表達水平。

1.4鼻黏膜上皮細胞培養 將鼻息肉組織〔4〕,用PBS沖洗后加入含有蛋白酶的培養液中,在4 ℃中放置18 h后制成細胞懸液。加入錐蟲藍后稀釋細胞懸液,在37 ℃,5%CO2的培養箱中培養1 h后放入細胞培養板中,加入轉鐵蛋白、胰島素、霍亂霉素、氫化可的松、維生素A酸,三碘甲狀腺氨酸、表皮生長因子、內皮細胞生長因子的培養基,隔天換液,培養3～4 d。

1.5細胞轉染 將對數生長期的鼻黏膜上皮細胞接種于培養板中,然后加入細胞懸浮液培養24 h。并分為MUC5AC對照組、MUC5AC siRNA組及MUC5AC si-NC組,IgE對照組、IgE siRNA組及IgE si-NC組,IL-35對照組、IL-35 siRNA組及IL-35 si-NC組,分別轉染磷酸鹽緩沖液、200 ng/ml miR-21 mimic和200 ng/ml miR-NC,轉染6 h后更換培養液。

1.6細胞凋亡檢測 將細胞接種于孔板中,處理后用預冷的PBS清洗2遍細胞,加入緩沖液制成重懸細胞,加入5 μl膜聯蛋白Ⅴ-異硫氰酸熒光素(FITC-AnnexinⅤ)混勻后加入染料,室溫下避光孵育15 min,將細胞懸浮液在流式細胞儀上檢測,統計細胞凋亡率。

1.7凋亡蛋白caspase3檢測 轉然后細胞培養48 h,在冰上進行裂解反應,在12 000 r/min的離心機上離心15 min,收取上清液后用BCA試劑盒檢測caspase3蛋白表達水平。

1.8統計學方法 采用SPSS22.0軟件進行獨立樣本t檢驗、單因素分析。

2 結 果

2.1鼻黏膜上皮細胞培養情況 培養24 h后,細胞圓形,為貼壁生長時期,部分呈多角形;3 d后細胞多聚集生長,呈長梭形;6 d后細胞集落進一步增大、增多。見圖1。

圖1 鼻黏膜細胞生長情況(×200)

2.2鼻息肉組織相對蛋白表達 IL-35在鼻息肉組織中的表達顯著低于鼻甲組織(P<0.05)。MUC5AC、IgE在鼻息肉組織中表達顯著高于鼻甲組織(P<0.05)。見表1。

表1 MUC5AC、IgE、IL-35鼻息肉組織中表達比較

2.3轉染后相對蛋白表達 MUC5AC、IgE、IL-35的si-NC組(1.31±0.40、0.74±0.31、0.59±0.06)轉染與其相對應的對照組相對蛋白表達(1.32±0.42、0.78±0.36、0.60±0.03)差異無統計學意義(P>0.05)。在轉染特異性siRNA后,其相對應的相對蛋白表達量(0.78±0.36、0.41±0.12、0.22±0.03)均明顯降低(均P<0.05)。

2.4細胞凋亡變化 IL-35對鼻黏膜上皮細胞凋亡具有抑制作用,結果顯示,IL-35 siRNA組細胞凋亡率〔(25.16±3.02)%〕顯著高于si-NC組〔(17.85±2.37)%;t=4.661,P<0.01〕。MUC5AC可以促進鼻黏膜上皮細胞凋亡,MUC5AC siRNA組凋亡率〔(10.29±2.04)%〕明顯低于si-NC組(t=5.920,P<0.01)。IgE siRNA組細胞凋亡率〔(8.22±1.84)%〕明顯低于si-NC組(t=7.846,P<0.01)。見圖2。

圖2 各組轉染后細胞凋亡的影響

2.5凋亡相關蛋白caspase3表達 IL-35 siRNA組caspase3表達量(1.21±0.07)相對于對照組(1.02±0.04)明顯升高(P<0.05)。IgE siRNA組、MUC5AC siRNA組caspase3表達量(0.33±0.02、0.47±0.05)相對于對照組明顯降低(P<0.05)。見圖3。

1～4:對照組、IL-35 siRNA組、IgE siRNA組、MUC5AC siRNA組圖3 各組凋亡相關蛋白caspase3表達

3 討 論

慢性鼻-鼻竇炎是耳鼻喉科常見的一類鼻腔黏膜變性疾病,發病后會嚴重影響到患者生活質量及健康狀況,主要臨床特征有鼻塞、流膿涕、嗅覺下降及頭痛〔4〕。鼻息肉是慢性鼻-鼻竇炎特殊類型,也是常見慢性炎癥反應疾病。RNA干擾(RNAi)是特異性的RNA轉錄后出現基因沉默現象。在上世紀末期發現的RNAi其實是siRNA與對應的mRNA特異結合、降解來阻止mRNA翻譯,引起生物細胞內同源基因發生特異性沉默,已經成為調控基因表達的方法之一〔5〕。研究RNAi技術對疾病發生和基因改變的機制,能夠幫助專家進一步了解通過基因影響細胞,為從基因水平疾病治療提供理論依據和思路〔6〕。

MUC是一類主要由多糖組成的糖蛋白,因其大分子結構影響黏液的流變學特性。已發現的20種黏蛋白中,絕大多數的黏蛋白的表達在人呼吸道黏膜中。MUC5AC被認為是呼吸道黏液的重要成分〔7〕。正常的人體中,多種黏蛋白對黏膜有著很大的保護作用,其中MUC5AC對氣道黏液高分泌反應具有重要的指導意義,MUC5B可以清除病毒,具有非特異性免疫應答作用,MUC7對細菌具有清理作用〔8,9〕。本研究結果顯示,鼻息肉組織中MUC5AC過表達,MUC5AC siRNA組成功誘導鼻黏膜細胞MUC5AC基因沉默,轉染后免疫組化檢測顯示MUC5AC表達被靶向抑制。染色凋亡結果表明,下調MUC5AC可降低鼻黏膜細胞凋亡。caspase蛋白是細胞凋亡主要蛋白,其中caspase3是執行凋亡的啟動者。通過激活caspase3,觸發相關凋亡的蛋白表達。并且caspase3蛋白表達水平與臨床多種疾病產生與發展過程密切相關,凋亡蛋白可能參與鼻息肉的發病過程。本研究結果提示,MUC5AC蛋白可能通過調控caspase3來影響鼻黏膜上皮細胞凋亡。

IgE如今大多數用于診斷過敏反應的主要指標〔10〕,雖然IgE在人類的血清中含量較少,但其在免疫炎癥免疫反應中起重要作用〔11〕。IgE對鼻竇炎鼻息肉的發生有重要影響,IgE介導的過敏反應引起鼻炎、鼻竇疼痛、癢等多種癥狀。研究表明,IgE在鼻息肉中的表達水平增加,引發嚴重的嗜酸性炎癥〔12,13〕。但IgE介導的鼻息肉促炎反應的調控機制仍有待充分研究。

IL-35作為自身免疫性調控因子在疾病中被研究,其作用是通過誘導T淋巴細胞的功能紊亂來抑制機體的免疫功能,同時還能夠調節多類細胞因子〔14,15〕。IL-35參與疾病炎癥反應發生,如哮喘和變應性鼻炎等,它在多種疾病表達有明顯差異〔16,17〕。本研究結果推測,可能是IL-35通過抑制caspase3表達來抑制鼻黏膜細胞凋亡。有學者猜測〔18〕,IL-35通過誘導Treg細胞抑制免疫反應,所以鼻息肉組織IL-35表達水平也低于正常人。

綜上,IL-35在鼻息肉組織中低表達,MUC5AC、IgE在鼻息肉組織中高表達,沉默MUC5AC、IgE的表達能抑制鼻黏膜細胞凋亡,沉默IL-35能促進鼻黏膜細胞凋亡。