基于細胞自噬JNK信號通路探討通絡糖泰方對高糖環境下大鼠雪旺細胞的影響

李周泉 李宇宸 唐瑩 李慧 楊莉君 姜迎宏 殷麗平

(成都中醫藥大學 1附屬醫院內分泌科,四川 成都 610075;2研究生院)

糖尿病周圍神經病變(DPN)是一種困擾超半數糖尿病患者造成其殘疾甚至死亡、嚴重影響生存質量的糖尿病并發癥〔1〕。雪旺細胞是一種保護神經元、促進軸突再生,起神經修復作用的膠質細胞〔2〕,它在DPN發生發展中至關重要,異常代謝因素持續損傷雪旺細胞會阻礙周圍神經修復〔3〕。自噬是一種細胞適應應激,將待降解蛋白質和細胞器進行自我更新以滿足代謝需要和支持細胞生長生存的過程〔4〕,研究顯示調控雪旺細胞自噬可能是一種靶向治療DPN的手段〔5〕,然而Gomez-Sanchez等〔6〕發現雪旺細胞自噬可能并非通過傳統常見的雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信號通路,而是通過c-JUN氨基末端蛋白激酶(JNK)信號通路實現對自噬的調節,但相關研究仍處于初級階段〔7〕。通絡糖泰方是成都中醫藥大學附屬醫院研制的一種中藥制劑,由黃芪、當歸、地骨皮、水蛭、蠶沙、川牛膝、玄參、赤芍和冰片等藥物構成〔8〕,在臨床應用上取得良好反饋,在基礎研究中發現其可一定程度下調大鼠坐骨神經磷酸化(p)-JNK、JNK mRNA、半胱天冬蛋白酶(Caspase)-3 蛋白的表達,上調促生長因子(IGF)-1 mRNA的表達,降低大鼠血清腫瘤壞死因子(TNF)-α、白細胞介素(IL)-6、C反應蛋白(CRP)、髓鞘堿性蛋白(MBP)水平,提高大鼠感覺神經傳導速度等〔9～12〕。因此本研究主要基于JNK信號通路,探討通絡糖泰方在高糖環境下對大鼠雪旺細胞自噬相關蛋白的影響。

1 材料與方法

1.1實驗動物、細胞、主要試劑及儀器 SPF級SD雄性大鼠30只,體質量200～250 g,由成都森威實驗動物有限公司提供。本實驗經成都中醫藥大學動物倫理委員會批準。大鼠雪旺細胞(RSC96) 上海賽佰康生物技術股份有限公司提供;通絡糖泰方浸膏(TLTT) 成都中醫藥大學附屬醫院提供(批號20201108);甲鈷胺片(彌可保,MKB) 中國衛材藥業有限公司生產;細胞計數CCK-8試劑盒檢測盒、重組Anti-JNK1+JNK2+JNK3抗體、重組Anti-自噬關鍵分子醇母Atg6同第物(Beclin)1抗體、重組Anti-微管相關蛋白1輕鏈3(LC3Ⅱ)抗體由Abcam公司生產;細胞自噬染色檢測試劑盒由北京索萊寶科技有限公司生產;辣根過氧化物酶標記兔二抗、極超敏電化學發光(ECL)試劑盒由南京碧云天生物公司生產;基因PCR引物由成都耶達科技有限公司合成;SureScriptTMcDNA第一鏈合成試劑盒與BlazeTaqTMSYBR Green Qpcr Mix試劑盒由美國GeneCopoeia公司生產;多功能酶聯免疫分析儀由山東博科生物公司提供;實時熒光定量PCR儀由美國ABI公司提供。

1.2含藥血清制備 30只SPF級SD大鼠適應性喂養3 d后,將其隨機分為空白組、彌可保組和通絡糖泰(通絡)組,每組各10 只,彌可保組給予劑量為0.25 mg/(kg·d)MKB,通絡組給予劑量10 mg/(kg·d)TLTT,空白組大鼠給予等體積生理鹽水,各組均連續給藥3 d。末次灌胃2 h后,無菌前提下藥物麻醉后于腹主動脈取血,離心取血清于無菌離心管,經滅活滅菌處理后保存-80 ℃冰箱保存。

1.3細胞培養及分組干預 根據前期課題組數據〔13〕及預實驗結果確定通絡糖泰含藥血清以5%、10%、20%濃度為佳,取對數生長期的雪旺細胞分為6組,按1×105/ml的密度接種于6孔細胞培養板中,并進行分組干預:空白組(5.6 mmol/L葡萄糖+10%空白血清)、模型組(50 mmol/L葡萄糖+10%空白血清)、彌可保組(50 mmol/L葡萄糖+10%含彌可保血清)、低劑量通絡組(50 mmol/L葡萄糖+5%通絡糖泰血清)、中劑量通絡組(50 mmol/L葡萄糖+10%通絡糖泰血清)和高劑量通絡組(50 mmol/L葡萄糖+20%通絡糖泰血清)。各組均在37 ℃、5%CO2細胞孵育箱中培養。

1.4CCK-8計數法檢測各組雪旺細胞活性 將細胞以每孔5×103細胞數接種于96孔細胞培養板,共制作3塊培養板(24 h板、48 h板和72 h板)。待24 h細胞貼壁后,按照分組更換培養液,每組5個復孔,24、48和72 h后按照試劑說明書滴加顯色試劑繼續孵育1 h,最后采用多功能酶標儀測量吸光度(A)值,每個實驗重復5次。

1.5流式細胞術檢測各組雪旺細胞凋亡率 將細胞以每孔1×105細胞數接種于6孔細胞培養板,待24 h貼壁后換液培養48 h,胰酶消化收集細胞,磷酸鹽緩沖液(PBS)潤洗細胞2次,加入結合緩沖液500 μl,先后加入5 μl膜聯蛋白(Annexin)V-異硫氰酸熒光素(FITC)和5 μl碘化丙啶(PI),室溫下避光孵育10 min,放入流式細胞儀檢測細胞凋亡,細胞凋亡率=早期細胞凋亡率(Q2)+晚期細胞凋亡率(Q3),實驗重復3次。

1.6細胞自噬熒光染色法檢測各組雪旺細胞自噬泡 根據細胞自噬染色試劑盒要求,將已更換血清并培養在6孔細胞培養板上48 h的各組貼壁細胞去除培養液,用去離子水稀釋后的1× Wash Buffer清洗后直接加入單丹(磺)酰戊二胺(MDC)染色劑室溫避光染色1 h,染色結束用1×清洗緩沖液清洗后,熒光顯微鏡下觀察并拍照,最后用Image J進行熒光強度半定量分析,平均熒光強度=該區域熒光強度總和/該區域面積。

1.7Western印跡法檢測各組雪旺細胞p-JNK、Beclin1和LC3Ⅱ蛋白表達 貼壁生長并以含藥血清干預48 h后的RSC96細胞,使用上樣緩沖液進行裂解,經二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量后,根據10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)試劑盒制備電泳凝膠后進行電泳轉印、封閉處理、抗體孵育,最后通過化學發光儀獲取條帶影像并用ImageJ軟件分析計算條帶灰度值進而計算蛋白表達水平。目的蛋白表達水平=目的蛋白條帶灰度值/內參蛋白條帶灰度值,每個實驗重復3次。

1.8實時熒光定量聚合酶鏈反應(RT-PCR)檢測各組雪旺細胞p-JNK、Beclin1和LC3Ⅱ mRNA表達 引物序列由成都市耶達科技有限公司設計合成:LC3Ⅱ上游引物:5′-GACGCCTTATGTAGTGACTCGC-3′,下游:5′-TCCTGGAAAGAGGATTTTGTGGC-3′;p-JNK上游引物:5′-GCTACAAGGGTGAGAAGCAGCT-3′,下游:5′-CTGGTTCACCAGCAGGAAGAAG-3′;Beclin1上游引物:5′-CTGGACACTCAGCTCAACGTCA-3′,下游:5′-CTCTAGTGCCAGCTCCTTTAGC-3′;GAPDH上游引物:5′-GGTGAAGGTCGGTGTGAACG-3′,下游:5′-CTCGCTCCTGGAAGATGGTG-3′。將貼壁生長并以含藥血清干預48 h后的RSC96細胞,根據TRIzol法提取總RNA,根據第一鏈 cDNA 合成試劑盒和qPCR Mix試劑盒說明書構建體系為20 μl的互補cDNA,采用2-ΔΔCt法進行相對定量分析。每個樣品重復實驗3次。

1.9統計學分析 采用SPSS26.0軟件進行單因素分析,方差齊時采用多重比較法(Turkey),方差不齊時采用DunnettT3檢驗。

2 結 果

2.1雪旺細胞活性表現 與空白組比較,模型組雪旺細胞在48、72 h培養后活力顯著降低(P<0.01);與模型組比較,彌可保組和高劑量通絡組雪旺細胞在48和72 h培養后活力明顯增加(P<0.05)。見表1。

表1 各組雪旺細胞活性比較

2.2各組雪旺細胞凋亡比較 與空白組比較,其余5組凋亡細胞百分比均顯著升高(P<0.01),與模型組比較,彌可保組和高劑量通絡組凋亡細胞百分比明顯下降(P<0.01)。見圖1、表2。

圖1 各組細胞凋亡比較

表2 各組雪旺細胞凋亡率、自噬泡熒光強度及p-JNK、Beclin1、LC3Ⅱ蛋白和mRNA比較

2.3各組雪旺細胞自噬泡表現 與空白組比較,模型組自噬泡明顯減少(P<0.01);與模型組比較,彌可保組和高劑量通絡組自噬泡顯著增加(P<0.01)。見表2、圖2。

圖2 各組細胞自噬泡熒光(MDC染色)

2.4各組雪旺細胞p-JNK、Beclin1和LC3Ⅱ蛋白和mRNA表達 與空白組比較,模型組p-JNK蛋白和mRNA表達水平顯著升高,Beclin1和LC3Ⅱ蛋白和mRNA表達水平顯著降低(P<0.01);與模型組比較,彌可保組和高劑量通絡組p-JNK蛋白和mRNA表達水平顯著降低,Beclin1和LC3Ⅱ蛋白和mRNA表達水平明顯升高(P<0.05)。見表2、圖3。

1～6:空白組、模型組、彌可保組、低劑量通絡組、中劑量通絡組、高劑量通絡組圖3 各組p-JNK、Beclin1、LC3Ⅱ蛋白表達

3 討 論

雪旺細胞是一種周圍神經系統特有并主要構成有髓神經纖維髓鞘的膠質細胞,在周圍神經病變中具有維持神經原有結構與功能、修復損傷和促進神經元軸突再生的重要作用〔14〕。自噬是細胞對內外環境壓力變化的一種反應,在正常情況下,自噬處于相當低的水平,主要清理衰老損傷的細胞器和蛋白質轉化,但當機體處于應激狀態時,細胞自噬被激活,表現為自噬增強。但當刺激程度過強時,又進一步發展為自噬受損,最后自噬失敗再通過凋亡途徑最終促成細胞死亡〔15,16〕。若細胞發生自噬,則需要進一步檢測自噬在細胞死亡中的角色:一方面,細胞通過自噬加強對功能受損的蛋白質和細胞器進行識別、降解和修復,從而抑制細胞死亡;另一方面,大量細胞實驗證明自噬能誘發凋亡等非自噬性細胞死亡途徑,從而促進細胞死亡〔17〕。

JNK是一類調控細胞存活、轉化、增殖和死亡的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶,JNK信號通路是細胞在生理和病理狀態中的重要調節靶標和細胞信息傳遞交匯點〔18〕。JNK參與多種自噬和凋亡通路的調節,研究提示阻斷JNK信號通路可能是預防和治療DPN的潛在靶點〔19,20〕。糖尿病高糖環境下,機體JNK信號通路被激活,細胞從低水平自噬轉向自噬增強,但持續應激狀態下自噬被抑制,出現細胞凋亡直至死亡。本研究結果說明,高糖環境對細胞的刺激過強導致細胞自噬受損,通絡糖泰方可能通過抑制JNK信號的活化,減少細胞凋亡,促進自噬發生。

MDC可與自噬囊泡膜上存在自噬體形成依賴的第二個泛素樣結合系統Apg8特異性結合,因此其可判斷細胞自噬過程是否發生,但MDC不僅可以與自噬體發生結合,還能與胞質內所有酸性液泡結合,因此需結合Western印跡實驗進一步證明〔21〕。Beclin1是一種持續招募自噬相關蛋白介導自噬啟動并參與調控自噬體雙層膜形成過程的關鍵調節因子,LC3是自噬體膜和自噬溶酶體膜的特征性標志物,分為LC3Ⅰ和LC3Ⅱ,而LC3Ⅱ是與自噬體相關唯一可靠的標記蛋白,在一定程度上可反映細胞自噬的活性,因此Beclin1和LC3Ⅱ是檢測自噬水平的兩種關鍵生物標志物〔22,23〕。本研究結果說明,高糖環境下雪旺細胞自噬活性被抑制,給予通絡糖泰血清處理后,Beclin1和LC3Ⅱ表達均得到改善,說明通絡糖泰方可能提高了細胞自噬活性。

綜上所述,通絡糖泰方可通過降低p-JNK蛋白的表達,抑制高糖環境下JNK信號通路的異常激活,提高細胞自噬活性和自噬相關蛋白Beclin1與LC3Ⅱ的表達,改善JNK信號通路參與的雪旺細胞凋亡與自噬。