醒腦灌腸液聯合健脾益智膠囊對腦卒中大鼠TrkB表達、運動功能、Notch1信號的影響

張曉冬 尹金磊 籍胤璽 關素珍 郭磊 黃蕾 傅國惠

(南陽市中心醫院,河南 南陽 473009)

腦卒中是臨床常見的腦部疾病之一。缺血性腦卒中是腦部動脈內出現斑塊,持續性誘導海馬組織出現氧血不足,也有部分患者是由于機體內栓子類物質循環進入腦部血管,紊亂腦部供血功能,血液流量減少,導致海馬組織出現氧氣和供血不足等事件發生〔1〕。由于醫療水平提升,老年化程度增加,導致腦卒中的患病人數持續增加。目前,臨床中,對于該病的治療要采用具體分析,對癥治療,雖然在一定程度上緩解病情,但是在另一方面也延長了患者的治療時間〔2〕。原肌球蛋白受體激酶(Trk)B主要分布在海馬區域,對大鼠腦部疾病變化較為敏感〔3〕。研究人員在腦部病變大鼠體內檢測到Notch1信號異常表達,首次將Notch1與腦部、神經等疾病聯系起來〔4〕。Notch1表達水平在人體神經性疾病中占重要地位。Notch1是很多關鍵信號的交匯點,該信號能直接激活相關轉錄因子的表達〔5〕。但在腦卒中、腦梗死等多種腦部疾病中Notch1的作用機制還較為模糊。現代藥理研究顯示,醒腦灌腸液具有通腑泄熱、滌痰逐瘀、醒腦開竅之功效,能夠起到擴張血管、增加腦血流量、減少微栓塞的作用〔6〕。研究顯示,腦與脾二者在機體生命活動中相互制約又相互依賴,采用健脾、滋補類藥物治療后阿爾茨海默病大鼠的記憶、學習能力得要明顯改善,因此,猜測健脾益智膠囊可能對腦卒中大鼠有治療作用〔7〕。本研究旨在探討醒腦灌腸液聯合健脾益智膠囊對腦卒中大鼠TrkB表達、運動功能、Notch1信號的影響。

1 材料與方法

1.1一般材料 在青島市藥品檢驗所購買40只健康雄性SD大鼠,體質量220～270 g,鼠齡3～4 w。將所選取的大鼠隨機分為模型組(M組,制作腦卒中模型)、對照組(D組,僅在頸部動脈處做小切口)、醒腦灌腸液組(X組,建立缺血性腦卒中模型后給予醒腦灌腸液);健脾益智膠囊組(J組,建立缺血性腦卒中模型給予健脾益智膠囊)、醒腦灌腸液聯合健脾益智膠囊組(L組,建立缺血性腦卒中模型后給予醒腦灌腸液聯合健脾益智膠囊),每組6只。

1.2模型制備 常規麻醉大鼠,頸部正中切口,找到頸內動脈,參照 Longa 線栓法〔8〕,選取規格為2.0 cm×0.2 mm的阻塞線,將阻塞線插入至大腦中動脈的入口,缺血3 h后拔線栓,血管結扎,創口縫合、消毒。麻醉清醒后觀察其行為學改變,采用Longa評分標準〔9〕進行選擇,0級:行為無明顯變化;1級:左前肢屈曲,左后肢伸展;2級:有左側追尾現象,左轉圈;3級:行走困難,搖擺不定;4級:意識不清。將評級為1、2、3級的納入實驗。

造模成功后,X組給予醒腦灌腸液,取0.5～1.0 ml水煎劑(濃度為2 g/ml,每劑水煎100～200 ml,根據成人體重及劑量換算得出)經大鼠肛腸深部緩慢滴入腸內,每日1次。J組給予健脾益智膠囊混懸液15 ml/(kg·d)灌胃,每日1次,L組同時給予健脾益智膠囊、醒腦灌腸液治療,連續治療3 w。所有大鼠生存環境相同。各組模型制備成功后進行相關實驗,完成后處死,開顱取海馬組織用于相關指標測定。醒腦灌腸液由石菖蒲、郁金15 g、大黃、水蛭10 g、冰片3 g組成;健脾益智膠囊由白術、黃芪20 g、何首烏15 g、人參10 g、遠志、石菖蒲6 g及水蛭3 g組成。

1.3儀器與試劑 Step one plus PCR儀(生物應用,美國);氯仿(江蘇千勝,中國);兔抗人TrkB、Notch1抗體(上海北諾,中國)。

1.4神經功能評分 采用Carcia評分〔10〕評定各組神經功能,分別從自主活動、網屏試驗等6個方面進行評分,評分為3～18分,得分越低,神經功能越差。

1.5運動功能 使用大鼠抓力計對各組大鼠的左前肢抓力進行測試。選用倒三角形抓桿,抓桿后方連拉力傳感器,抓桿高度始終保持一致,將大鼠置于實驗臺上,當向后拉鼠尾時,大鼠抓住抓桿,繼續向后拉鼠尾直到實驗人員的拉力超過大鼠前肢的最大抓力,儀器將自動記錄大鼠在整個抓握過程中最大的抓力(單位:g)。測試5次,取平均值。

1.6組織免疫化學染色法檢測大鼠海馬組織中TrkB蛋白陽性表達情況 去大鼠大腦海馬組織,做切片常規脫蠟、水化,加阻斷過氧化物酶,PBS 漂洗,加一抗 TrkB(1∶150),孵育,漂洗,加二抗,重復以上步驟,甩干后滴加DAB顯色劑,蘇木素,脫水、透明、封片,觀察。

1.7Western印跡檢測Notch1蛋白含量 將海馬組織進行裂解并提取核蛋白,并對核蛋白的濃度進行測量,分裝后,保存在-20 ℃的環境中。將提取出的蛋白溶液和緩沖溶液照4∶1的比例進行混合,然后將其煮沸,變性。蛋白加脫脂奶粉放聚偏氟乙烯(PVDF)膜上,封閉。加入1抗,TTBS漂洗3次,加2抗,封閉1 h。TTBS漂洗,DAB顯色,拍照。

1.8實時熒光定量聚合酶鏈反應(qRT-PCR)檢測TrkB、Notch1 mRNA表達量 把保存在-80 ℃環境中海馬組織取出,研磨,提取總RNA,進行逆轉錄。所有反應嚴格按照反應的條件進行擴增,內參采用GAPDH,變性3 min 95 ℃,變性5 s 95 ℃,退火1 min 60 ℃,共進行40次。引物序列:TrkB:上游引物:5′-GAACGACAACCCGACATT3-3′、下游:5′-AGACGTGGATCTGGAGTGA-3′,Notch1:上游引物:5′-GGCG-AACGCACGTT3-3′、下游:5′-GAGACACGCGCGCGT-3′,GAPDH:上游引物:5′-TGGACTCTACTGGCG-TCTT-3′、上游:5′-TGTCATATTTCTCGTGGTTCA-3′,取得平均值后得到Ct值,計算方法用2-ΔΔCt法進行分析。

1.9統計學分析 采用SPSS22.0軟件進行方差分析,組間兩兩比較采用t檢驗。

2 結 果

2.1大鼠神經功能評分及運動功能比較 各組在神經功能及運動功能評分存在時間、組間相互作用(P<0.01)。與M組相比,X、J、L、D組治療后第10、21天的神經功能評分、運動功能均明顯升高(P<0.05);與X組及J組相比,L、D組治療后第10、21天的神經功能評分、運動功能均明顯升高(P<0.05),且D組明顯高于L組(P<0.05)。M、X、J、L組在治療后第1天的神經功能評分及運動功能比較均差異無統計學意義(P>0.05),但D組與其他各組比較兩個指標均明顯升高(P<0.05);組內不同時間相比,各組均隨著時間的升高神經功能評分及運動功能均明顯增加(P<0.05)。見表1。

表1 各組神經功能評分及運動功能比較

2.2組織免疫化學染色法檢測TrkB蛋白陽性表達 M組、X組、J組、L組及D組海馬組織中TrkB蛋白陽性數目分別為(19.52±1.05)、(23.40±1.22)、(24.06±1.09)、(42.71±4.20)及(63.55±6.07)個,組間差異顯著(P<0.05)。D組海馬組織的TrkB陽性蛋白數最高,M組TrkB蛋白陽性數目最低,與M、X、J、L組比較,L組TrkB陽性數目顯著升高(均P<0.05)。X、J組體內TrkB陽性數差異無統計學意義(P>0.05)。見圖1。

圖1 TrkB蛋白陽性表達(蘇木素染色,×200)

2.3Western印跡檢測Notch1蛋白含量 M組、X組、J組、L組及D組海馬組織中Notch1蛋白表達分別為0.57±0.14、0.58±0.13、0.60±0.10、0.68±0.22及0.85±0.19,組間差異顯著(P<0.05)。D組海馬組織的Notch1蛋白含量最高,M組含量最低,與M、X、J、L組相比較,D組海馬組織中Notch1蛋白含量顯著升高(均P<0.05)。X組、J組海馬組織中Notch1蛋白含量差異無統計學意義(P>0.05)。見圖2。

圖2 Western印跡檢測各組海馬組織中Notch1蛋白表達

2.4qRT-PCR法檢測TrkB、Notch1 mRNA表達量 D組海馬組織的TrkB、Notch1 mRNA表達量最高,M組mRNA表達量最低,與M、X、J、L組比較,D組海馬組織TrkB、Notch1 mRNA表達顯著升高(均P<0.05),X組、J組海馬組織中TrkB、Notch1 mRNA表達量差異無統計學意義(P>0.05)。見表2。

表2 各組海馬組織中TrkB、Notch1 mRNA表達量

3 討 論

缺血性腦卒中是最常見的腦卒中類型,缺血性腦卒中是由于海馬組織出現長時間的氧血不足引起腦部疾病。目前,由于組織缺血缺氧造成了廣泛的皮質和皮質下損傷,遺留下各種功能障礙,包括:感覺運動功能、吞咽障礙等,其中,以感覺運動功能障礙最為多見〔11〕。缺血性腦卒中臨床表現為海馬組織出現病變,神經功能喪失、運動、語言出現障礙等癥狀。因此,該病的發現時間與治療時間與患者預后呈正相關關系,越早的治療,越能控制病情的發展,對治療該病有顯著作用〔10〕。

文獻報道,腦卒中會使患者出現偏癱、運動功能障礙等相關并發疾病,現今,有許多藥物可以達到治療效果,但西藥長時間服用存在一定副作用,本文從兩種不同療效中藥對腦卒中大鼠模型進行試驗,探究中藥對腦卒中的改善效果及機體作用機制〔12〕。大鼠前肢精細運動功能評價是腦卒中后治療及康復手段神經功能評價的重要研究方向。前肢的感覺-運動綜合反應是由感覺系統和運動系統共同參與的復雜神經調控,除了前肢運動空間定位,還受到視覺、嗅覺、自我情感等多種因素調控〔13〕。本研究結果表明,醒腦灌腸液與健脾益智膠囊對腦卒中大鼠的神經系統及肢體恢復均有一定作用,但單一藥物治療效果欠佳,兩種藥物聯合治療,能夠同時發揮藥效,從不同方向進行作用。本研究結果與Taiping等〔14〕研究結果相符,在大鼠腦卒中發生后及時給予醒腦灌腸液進行治療,能夠顯著緩解大鼠因腦部缺血所導致的神經癥狀,減輕運動障礙,恢復前肢運動能力。研究顯示〔15〕,健脾益智膠囊中白術、石菖蒲、水蛭等中草藥能夠對腦卒中患者的機體狀態、器官功能、臨床癥狀等方面有顯著改善作用,恢復患者日常生活能力。實驗研究結果顯示〔16〕,健脾益智膠囊方中人參、黃芪具有強健脾氣、益智寧神、通暢血運、以養五臟的功效,何首烏、石菖蒲、水蛭有豁痰醒腦、交通心腎、可補五臟之不足、健脾之功效。健脾益智膠囊對腦卒中昏迷具有顯著效果,未見明顯不良反應。醒腦灌腸液具有通腑泄熱、滌痰逐瘀、醒腦開竅之功效。其中,大黃苦寒,能通腑瀉下,引火下降;郁金性味辛苦、涼,行氣解郁、涼血破淤;冰片能很快透過血腦屏障,增加血腦屏障通透性,起到醒腦開竅的作用;水蛭減輕周圍組織炎癥反應的水腫,緩解顱內壓,起到逐瘀開竅的作用〔17〕。現代藥理研究顯示,諸藥具有擴張血管、降低血管阻力、減少毛細血管通透性、增加腦血流量、清除自由基、抑制血小板聚集、降低血黏度、減少微栓塞、改善血流動力學指標、改善肢體 運動功能障礙等作用〔18〕。

Notch信號通路在人體神經性疾病和機體發育中都發揮著重要作用,如介入并調整了細胞凋亡、侵襲、遷移及血管的產生等生理病理歷程〔19〕。在不同疾病中,Notch可能通過抑制細胞增殖或誘導凋亡來體現自身作用。本研究表明,中藥治療腦卒中大鼠的作用機制可能與TrkB、Notch1等信號的表達水平存在一定的相關性。實驗結果表明〔20〕,通過運動訓練聯合中藥的干預,腦卒中大鼠的BDNF、TrkB蛋白表達受到了明顯的影響,表明運動訓練聯合中藥治療相對于單一運動治療腦卒中后可得到更好的治療效果,運動訓練聯合中藥治療是治療腦卒中的有效方法之一。實驗表明〔21〕,腦卒中大鼠與正常大鼠相比較,體內TrkB、Notch1表達水平存在顯著差異,表明TrkB、Notch1參與腦卒中的發生發展過程。研究發現〔22〕,醒腦灌腸液與健脾益智膠囊干預能夠顯著改善腦卒中大鼠的運動障礙,緩解前肢抓地情況,同時促進了海馬組織中TrkB、Notch1的表達,繼而推測,醒腦灌腸液與健脾益智膠囊治療可能通過上調TrkB、Notch1表達來實現治療腦卒中大鼠的運動障礙的作用。