中藥千金子二萜醇對腎癌786-0細胞移植瘤S期激酶相關蛋白2的影響

龔永明 周磊 宋圣佑 趙俊峰

(1河南省中醫院 河南中醫藥大學第二附屬醫院泌尿外科,河南 鄭州 450002;2河南中醫藥大學第二臨床醫學院)

腎細胞癌起源于腎小管上皮細胞,簡稱腎癌,在泌尿系統中僅次于膀胱癌和前列腺癌,是泌尿系統中致死率最高的惡性腫瘤。腎癌的發病原因及其發生發展的生物學機制仍不明確,有研究發現S期激酶相關蛋白(Skp)2對腎細胞癌的形成有一定影響,同時也有研究發現中藥千金子二萜醇可抑制腎臟癌細胞的增殖、侵襲和轉移。本研究旨在探討中藥千金子二萜醇對腎癌786-0細胞移植瘤Skp2的影響。

1 材料和方法

1.1材料與試劑 千金子二萜醇(四川維克奇生物科技有限公司);腎癌786-0細胞由(武漢普諾賽生命科學有限公司);4～8周齡的SPF級BALB/c裸鼠(北京斯貝福生物技術有限公司),16只(雌雄各半),體質量16～21 g;0.25%胰蛋白酶(北京索萊寶科技有限公司);10%胎牛血清及RPMI1640培養基(美國GIBCO公司);鼠抗人Skp2mAb、免疫組化(SP)試劑盒及二氨基聯苯胺(DAB)顯色劑(中杉金橋生物技術有限公司)。

1.2786-0細胞培養 將培養基中的786-0細胞在恒溫條件下完全培養到90%飽和,取生長狀態良好的細胞,首先用胰蛋白酶(濃度為0.25%)進行消化,然后再用胎牛血清培養液(濃度為10%)配成一定濃度的細胞懸液(細胞濃度為1×107個/ml)。

1.3構建移植瘤動物模型及分組 將配好的786-0細胞懸液(0.2 ml/只)分別皮下注射于每只裸鼠右前肢腋窩處,然后隨機分成兩組:對照組和實驗組,每組8只。

1.4監測移植瘤生長情況 自腫瘤細胞注射1 w起,瘤體生成后每天觀察成瘤情況,待瘤體生長無明顯差異后開始給予藥物干預。對照組移植瘤裸鼠給予等體積的生理鹽水灌胃,實驗組移植瘤裸鼠給予20 mg/kg千金子二萜醇溶液灌胃。藥物開始干預后每3 d用毫米游標卡尺分別測量瘤體的長、寬、高最大直徑(mm),依據腫瘤體積(V)計算公式:V(mm3)=長×寬×高/2,算出瘤體大小。在用藥21 d后處死裸鼠,切取瘤體組織備用。

1.5制作瘤體組織蠟塊及SP檢測 切取大小約1.0 cm×1.0 cm×0.5 cm的瘤體組織,均用濃度為10%甲醛固定,常規脫水及石蠟包埋后,對所有標本組織蠟塊常規切片,厚度4～5 μm,每張切片用DAB溶液顯色,蒸餾水終止反應,蘇木素-伊紅(HE)染色,然后作形態學觀察。SP染色法嚴格按SP試劑盒說明書仔細操作,選擇有代表性的腫瘤區域及進行標記。用已知乳腺癌標本作陽性對照,用等滲緩沖鹽溶液(TBS)代替一抗作陰性對照。

1.6結果判定制定判定標準 Skp2在胞核胞質中或只在胞核中表達為陽性,僅在胞質中表達為陰性。隨機取5個高倍視野,然后計算每個高倍視野下陽性細胞數占總腫瘤細胞數的比率,最后再計算此5個高倍視野的平均百分比。Skp2陽性細胞數<10%為陰性,≥10%為陽性,結果判定由2人一起完成,取兩人測得平均數。

1.7統計學分析 采用SPSS26.0軟件進行χ2檢驗。

2 結 果

裸鼠移植成瘤后灌藥21 d,處死裸鼠,將裸鼠瘤體組織剝離下來,然后用SP法檢測裸鼠瘤體組織Skp2表達,Skp2主要表達在細胞核中,也有部分表達在胞核胞質中。陽性染色呈現粗大棕黃色顆粒,見圖1。Skp2在對照組和實驗組的裸鼠瘤體中表達率分別為87.50%(7/8)和12.50%(1/8),兩組差異顯著(χ2=0.12,P=0.04)。

圖1 兩組瘤體組織Skp2表達(DAB,×200)

3 討 論

腎癌是泌尿系常見的惡性腫瘤之一,占腎腫瘤的85%以上〔1〕,占所有惡性腫瘤的2%。在大多數國家和地區,腎癌的發病率呈持續增長的趨勢〔2〕,每年約14萬人死于該病〔3〕,嚴重威脅人類的生命健康。腎癌的發病原因尚不明確,有研究發現腎癌的發病與家族遺傳、肥胖、職業、抽煙、飲食、糖尿病、高血壓、放射等多種因素有關,主要表現為血尿、腰部疼痛、腰部腫物等不適。腎癌的治療首選根治性腎切除術,由于腎癌對放療和化療均不敏感,因此不能作為常規的輔助療法。同時有研究發現,20%的腎癌患者首次就診時已經出現遠處轉移,這些患者需要新的輔助治療。近年來,隨著醫學的進步,發現了許多治療腎癌的新方法,比如免疫治療、靶向治療,為腎癌的治療帶來了新希望,但大部分患者在接受治療過程中由于獲得性耐藥而導致療效欠佳,進而成為進展性疾病〔4〕,導致有效的治療率仍較低〔5〕,再加免疫治療及靶向治療價格昂貴,仍不能普及應用,因此仍有待于積極尋找更新、更多樣化的治療方法。

研究發現,Skp2是叉頭盒(Fox)蛋白質家族成員,它與Skp1、Cullin和Rbx1共同構成,基因定位于人5號染色體短臂上(5p13),是一種泛素-蛋白連接酶復合物,是一個致癌基因,它調控著許多重要的生物學過程來促進腫瘤的發生、發展。研究發現,Skp2通過影響E鈣黏蛋白、周期蛋白激酶抑制因子(CKIs)、FOXM1、p57、基質金屬蛋白酶9蛋白表達水平等調節細胞的周期進程,影響細胞的凋亡和DNA的損傷,并可促進腫瘤細胞的糖酵解及調節腫瘤干細胞的分化等,進而影響腫瘤的發生、轉移和復發等〔6,7〕,已有研究報道Skp2在乳腺癌、淋巴瘤、前列腺癌等許多惡性腫瘤中高表達。Skp2高表達與腫瘤進展和預后不良正相關,在腎臟多種類型的惡性腫瘤中,如腎臟嫌色細胞癌、腎臟透明細胞癌和腎臟乳頭狀細胞癌,Skp2高表達者的生存期較低表達者明顯縮短,因此Skp2的高表達是腎癌預后欠佳的重要因素〔8〕。多種研究發現,Skp2與腫瘤的發生、發展和預后有緊密聯系,在多種惡性腫瘤中高表達,根據此特性,抑制Skp2表達成為治療惡性腫瘤的新方法之一〔9,10〕。

實驗研究發現,千金子可抑制多種惡性腫瘤的發生、發展〔11〕,已有報道千金子對白血病、食管癌、鼻咽癌等的治療均有很好的效果。千金子別名又叫千兩金、續隨子等,為大戟科植物,性溫,味辛,毒性小,主要含有大量脂肪油、二萜醇、香豆素等化合物,其中二萜醇類化合物是其主要成分,也是其重要的活性成分,主要用于內治水腫、痰飲、積滯脹滿、二便不通、血瘀經閉等,外治頑癬、疣贅。趙俊峰等〔12〕研究發現,千金子二萜醇可在體外抑制腎癌Renca細胞和人腎癌786-0細胞的增殖,促進腎癌Renca細胞的凋亡,并可抑制腎癌細胞的侵襲和遷移。

有研究發現,姜黃素在一定程度上能抑制結腸癌SW480細胞中Skp2的表達,通過調控Skp2-p27kip通路可能是其抑制結腸癌細胞增殖并促進其凋亡的分子機制之一〔13〕。丁虹等〔14〕研究發現,半枝蓮提取物能夠顯著誘導信號傳導轉錄激活因子(STAT)3信號的活化,降低Skp2表達,使腫瘤細胞在G0/G1期受阻,從而抑制腫瘤細胞的增殖,此研究結論為鼻咽癌的治療提供了新的思路與方向。

綜上,中藥千金子二萜醇能抑制786-0細胞移植瘤Skp2的表達,從而得出千金子二萜醇可通過另外一條機制起到治療腎細胞癌的作用。但目前的研究還停留在動物模型階段,對于臨床的應用效果及對不同類型的惡性腫瘤是否具有同樣的治療作用還需要進一步探索。