LncRNA FOXD3-AS1靶向miR-127-3p對AngⅡ誘導的血管平滑肌細胞的影響

杜美玲 王曉元 李會賢 李方江 李飛星

(河北北方學院附屬第一醫院心血管內科,河北 張家口 075400)

長鏈非編碼RNA(LncRNA)是長度大于200 nt蛋白編碼能力缺失的RNA轉錄本,其通過表觀遺傳、轉錄或轉錄后水平調控基因表達在細胞增殖、分化,遷移和侵襲等生物學過程中具有重要功能,LncRNA的表達改變與心腦血管疾病、腫瘤的進展密切相關〔1,2〕。叉頭盒轉錄基因D3反義RNA1(FOXD3-AS1)是近年發現的LncRNA,研究發現FOXD3-AS1表達上調明顯促進糖氧剝奪的心肌細胞凋亡和缺血/再灌注損傷〔3〕。膠質瘤、乳腺癌中FOXD3-AS1表達上調,具有促增殖、促遷移作用〔4,5〕。血管平滑肌細胞(VSMCs)是動脈粥樣硬化等心血管疾病進展的重要步驟。但FOXD3-AS1在VSMCs中的表達和功能未見報道。生物信息學預測顯示miR-127-3p是FOXD3-AS1的候選靶基因之一。miR-127-3p骨肉瘤組織中表達下調,上調miR-127-3p表達抑制骨肉瘤細胞的增殖,遷移和侵襲〔6,7〕。然而,FOXD3-AS1是否miR-127-3p參與調控VSMCs增殖、遷移、侵襲和凋亡尚未可知。本研究以血管緊張素(Ang)Ⅱ誘導人主動脈VSMCs,探討FOXD3-AS1在VSMCs增殖、遷移、侵襲及凋亡中的作用和潛在機制。

1 材料與方法

1.1主要試劑 杜氏改良Eagle培養基(DMEM)和胰蛋白酶購于美國Gibco公司;AngⅡ購于美國Sigma公司;小干擾RNA(si-RNA)、過表達質粒(pcDNA3.1-RNA)、miRNA模擬物(miRNA mimics)、miRNA抑制物(anti-miRNA)、熒光素酶報告基因載體合成、構建和測序由上海吉瑪制藥公司完成;實時熒光定量聚合酶鏈反應(RT-qPCR)試劑盒購于大量Takara公司;CCK-8、膜聯蛋白Ⅴ-異硫氰酸熒光素/碘化丙啶(Annexin Ⅴ-FITC/PI)雙染細胞凋亡試劑盒購于北京索萊寶生物技術有限公司;Transwell小室和基質膠購于美國Corning公司;兔源磷酸化磷脂酰肌醇3-激酶(p-PI3K)單克隆抗體、兔源磷酸化蛋白激酶B(p-AKT)單克隆抗體、兔源β-actin抗體單克隆購于美國CST公司;兔源細胞周期蛋白(Cyclin)D1單克隆抗體、兔源活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(C-caspase)-3多克隆抗體、兔源基質金屬蛋白酶(MMP)2多克隆抗體、兔源MMP9多克隆抗體、山羊抗兔IgGⅡ抗購于美國Abcam公司。

1.2方法

1.2.1細胞培養和分組 人主動脈VSMCs購于上海信裕生物工程有限公司,用DMEM于37 ℃、5%CO2的細胞培養箱培養,當細胞生長匯合度達到85%時,加入胰酶消化,磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌后加入細胞培養液,接種于6孔板進行實驗。分為對照(NC)組:正常培養的VSMCs;AngⅡ組:采用0.001 mol/L AngⅡ處理VSMCs 48 h;AngⅡ+si-con組:轉染si-con后進行AngⅡ處理;AngⅡ+si-FOXD3-AS1組:轉染si-FOXD3-AS1后進行AngⅡ處理;AngⅡ+miR-con組:轉染miR-con后進行AngⅡ處理;AngⅡ+miR-127-3p組:轉染miR-127-3p mimics后進行AngⅡ處理;AngⅡ+si-FOXD3-AS1+ anti-miR-con組:共轉染si-FOXD3-AS1和anti-miR-con后進行AngⅡ處理;AngⅡ+si-FOXD3-AS1+anti-miR-127-3p組:共轉染si-FOXD3-AS1和anti-miR-127-3p后進行AngⅡ處理。細胞轉染參照脂質體LipofectamineTM2000說明書進行瞬時轉染,收集轉染48 h細胞進行AngⅡ處理。

1.2.2RT-qPCR檢測FOXD3-AS1和miR-127-3p的表達水平 按照TRIzol使用說明提取各組HA-VSMC細胞的總RNA,逆轉錄試劑盒合成互補DNA(cDNA),以cDNA為模板,利用熒光定量試劑盒于ABI 7500型PCR儀上進行RT-qPCR擴增。FOXD3-AS1和miR-127-3p引物由上海生工公司合成,序列(5′-3′):FOXD3-AS1上游引物GAATAGTTGCCGA-GAGAAA,下游GACAGACAGGGATTGGGTT;miR-127-3p上游引物GGAAGATCTGTAGTCCTGTCTGTTGGTCAG,下游CCCAAGCTTCCTGAAGAACTGCTTCCGCC;β-actin上游引物AAGATGACCCAGATCA-TGTTTGAG,下游TAGATGGGCACAGTGTGGGTG;U6上游引物CTCGCTTCGGCAGCACA,下游AACG-CTTCACGAATTTGCGT。利用2-ΔΔCt法計算FOXD3-AS1和miR-127-3p的新的表達水平。

1.2.3CCK-8法檢測細胞增殖 將各組將HA-VSMC細胞接種于96孔板,貼壁后,每孔加入10 μl的CCK-8試劑,37 ℃避光孵育4 h。酶標儀檢測450 nm波長處各孔的吸光度(A)值,計算細胞存活率。

1.2.4流式細胞術檢測細胞凋亡 收集各組細胞,采用結合緩沖液制成1×106個/ml的細胞懸液。取100 μl的細胞懸液,分別加入5 μl的Annexin Ⅴ-FITC和5 μl的PI,室溫下加入400 μl的結合緩沖液,混勻后1 h內上流式細胞儀檢測細胞凋亡情況,見圖1。

圖1 凋亡細胞(×200)

1.2.5Transwell法檢測遷移和侵襲遷移實驗 無血清DMEM培養基稀釋各組細胞為5×105個/ml細胞懸液,取300 μl加入到Transwell小室,24孔板下室加入500 μl的含20%胎牛血清的培養基,37 ℃培養箱孵育24 h,經多聚甲醛室溫固定和結晶紫染色后,倒置顯微鏡下觀察細胞過膜情況,隨機選取3個視野,拍照記錄細胞遷移細胞數目。侵襲實驗:按照1∶8稀釋的基質膠鋪于在小室內,其他步驟參考遷移實驗。

1.2.6雙熒光素酶報告實驗驗證FOXD3-AS1和miR-127-3p的靶向關系 構建含有miR-127-3p結合位點的FOXD3-AS1的野生型(WT-FOXD3-AS1)和突變型(MUT-FOXD3-AS1)熒光素酶報告基因載體。將WT-FOXD3-AS1和MUT-FOXD3-AS1分別與miR-127-3p mimics和miR-con共轉染至VSMCs細胞,轉染48 h檢測各組VSMCs的熒光素酶活性。為證實FOXD3-AS1對miR-127-3p的調控關系,將pcDNA3.1、pcDNA3.1-FOXD3-AS1、si-con、si-FOXD3-AS1分別轉染VSMCs,轉染48 h時RT-qPCR檢測各組HA-VSMC細胞miR-127-3p的表達水平。

1.2.7Western印跡檢測CyclinD1、C-caspase-3、MMP2、MMP9、p-PI3K和p-AKT的表達 裂解各組細胞,測定蛋白樣品濃度。取等量蛋白進行聚丙烯酰胺凝膠電泳,并轉移至硝酸纖維素膜。膜封閉后,加入Ⅰ抗(β-actin和p-PI3K抗體1∶1 000稀釋,p-AKT抗體1∶2 000稀釋,其余為1∶500稀釋)室溫孵育2 h。加入Ⅱ抗(1∶2 000)低速搖床室溫孵育1 h。化學發光顯影后,以β-actin為內參,應用ImageJ軟件測定各組細胞的灰度值。

1.3統計學分析 采用SPSS18.0軟件進行t檢驗、方差分析、SNK-q檢驗。

2 結 果

2.1VSMCs中LncRNA FOXD3-AS1和miR-127-3p的表達情況 AngⅡ誘導后VSMCs中LncRNA FOXD3-AS1表達水平顯著升高,miR-127-3p表達水平顯著降低(P<0.001)。見表1。

表1 HA-VSMC中LncRNA FOXD3-AS1和miR-127-3p表達量

2.2抑制FOXD3-AS1表達對VSMCs增殖、凋亡、遷移和侵襲的影響 與NC組比較,AngⅡ組VSMCs FOXD3-AS1表達、CyclinD1、MMP2和MMP9蛋白表達、細胞存活率、細胞遷移、侵襲能力顯著升高,C-caspase-3蛋白表達、細胞凋亡率顯著降低(P<0.05);與AngⅡ+si-con組比較,AngⅡ+si-FOXD3-AS1組VSMCs FOXD3-AS1表達、CyclinD1、MMP2和MMP9蛋白表達、細胞存活率、細胞遷移、侵襲能力顯著降低,C-caspase-3蛋白表達、細胞凋亡率顯著升高(P<0.05)。見圖2、圖3、表2、圖4。

表2 低表達FOXD3-AS1對細胞增殖、凋亡、遷移和侵襲的影響

圖2 低表達FOXD3-AS1對細胞凋亡的影響

圖3 低表達FOXD3-AS1對細胞遷移和侵襲的影響(結晶紫染色,×200)

1～4:對照組、AngⅡ組、AngⅡ+si-con組、AngⅡ+si-FOXD3-AS1組圖4 低表達FOXD3-AS1對CyclinD1、C-caspase-3、MMP2、MMP9蛋白表達的影響

2.3過表達miR-127-3p對VSMCs增殖、凋亡、遷移和侵襲的影響 與AngⅡ+miR-con組比較,AngⅡ+miR-127-3p組VSMCs miR-127-3p表達、C-caspase-3蛋白表達、細胞凋亡率顯著升高,CyclinD1、MMP2和MMP9蛋白表達、細胞存活率、細胞遷移侵襲能力顯著降低(均P<0.001)。見圖5、圖6、圖7、表3。

表3 高表達miR-127-3p對HA-VSMC細胞增殖、凋亡、遷移和侵襲的影響

圖5 過表達miR-127-3p對VSMCs凋亡的影響

圖6 過表達miR-127-3p對VSMCs遷移、侵襲的影響(結晶紫染色,×200)

圖7 過表達miR-127-3p對VSMCs相關蛋白的影響

2.4LncRNA FOXD3-AS1靶向miR-127-3p 雙熒光素酶報告基因實驗顯示,與miR-con和WT-FOXD3-AS1共轉染組比較,miR-127-3p mimcis和WT-FOXD3-AS1共轉染組VSMCs相對雙熒光素酶活性顯著降低(P<0.05);與miR-con和MUT-FOXD3-AS1共轉染組比較,miR-127-3p mimcis和MUT-FOXD3-AS1共轉染組VSMCs相對雙熒光素酶活性變化無統計學意義。見圖8、表4。與pcDNA-con組(1.00±0.13)比較,pcDNA-FOXD3-AS1組VSMCs miR-127-3p表達水平顯著降低(0.40±0.04,P<0.05);與si-con組(0.98±0.10)比較,si-FOXD3-AS1組VSMCs miR-127-3p表達水平顯著升高(2.39±0.24,P<0.05)。4組差異顯著(F=298.854,P=0.000)。以上結果提示LncRNA FOXD3-AS1靶向負性調控miR-127-3p表達。

表4 相對熒光素酶活性檢測

圖8 LncRNA FOXD3-AS1靶向miR-127-3p

2.5抑制miR-127-3p表達可以部分逆轉抑制FOXD3-AS1對VSMCs增殖、凋亡、遷移和侵襲的影響 與AngⅡ+FOXD3-AS1+anti-miR-con組比較,AngⅡ+si-FOXD3-AS1+anti-miR-127-3p組VSMCs miR-127-3p表達、C-caspase-3蛋白表達、細胞凋亡率顯著降低,CyclinD1、MMP2和MMP9蛋白表達、細胞存活率、細胞遷移、侵襲能力顯著升高(均P<0.001)。見表5、圖9、圖10、圖11。

表5 低表達miR-127-3p可以部分逆轉FOXD3-AS1低表達對VSMC增殖、凋亡、遷移和侵襲的影響

1,2:AngⅡ+FOXD3-AS1+anti-miR-con組、AngⅡ+si-FOXD3-AS1+anti-miR-127-3p組;圖10、圖11同圖9 抑制miR-127-3p表達可以部分逆轉FOXD3-AS1對VSMCs凋亡的影響

圖10 抑制miR-127-3p表達可以部分逆轉FOXD3-AS1對VSMCs遷移和侵襲的影響(結晶紫染色,×200)

圖11 各組CyclinD1、C-caspase-3、MMP2、MMP9蛋白表達

2.6PI3K/AKT信號通路相關蛋白表達 與NC組比較,AngⅡ組VSMCs細胞p-PI3K和p-AKT表達水平顯著升高(P<0.05);與AngⅡ組比較,AngⅡ+si-FOXD3-AS1組VSMCs p-PI3K和p-AKT表達水平顯著降低;與AngⅡ+si-FOXD3-AS1+anti-miR-con組比較,AngⅡ+si-FOXD3-AS1+anti-miR-127-3p組VSMCs p-PI3K和p-AKT表達水平顯著升高(P<0.05)。見表6、圖12。

表6 各組PI3K/AKT信號通路相關蛋白表達

1～5:對照組、AngⅡ組、AngⅡ+si-FOXD3-AS1組、AngⅡ+FOXD3-AS1+anti-miR-con組、AngⅡ+si-FOXD3-AS1+anti-miR-127-3p組圖12 Western印跡檢測各組PI3K/AKT信號通路相關蛋白表達

3 討 論

AngⅡ在體外具有誘導VSMCs增殖、遷移和侵襲的作用,采用AngⅡ刺激VSMCs是研究動脈粥樣硬化常用的體外細胞模型。

FOXD3-AS1在高氧誘導的肺泡上皮細胞中表達上調,FOXD3-AS1高表達促進高氧誘導的肺上皮細胞死亡,加劇肺損傷〔8〕。FOXD3-AS1的上調與結腸癌患者的生存率較低相關,FOXD3-AS1可促進腫瘤生長,敲減FOXD3-AS1表達抑制腫瘤細胞增殖,遷移和侵襲及細胞周期并促進細胞凋亡〔9〕。然而在神經母細胞瘤組織和細胞系中FOXD3-AS1下調,高表達FOXD3-AS1可誘導神經元分化,降低神經母細胞瘤在體內外的侵襲能力〔10〕。本研究結果提示,FOXD3-AS1高表達可能與VSMCs細胞的異常生物學行為有關。MMP2和MMP9參與多種血管過程,其可催化和去除VSMCs周圍的細胞外基質,促進從VSMC從靜止狀態向增殖和遷移的活躍狀態轉變〔11,12〕。本研究結果提示,干擾FOXD3-AS1表達抑制VSMCs的增殖、遷移和侵襲能力,誘導細胞凋亡,對遏制動脈粥樣硬化進展具有一定積極意義。

LncRNA發揮miRNA分子海綿作用是近年來的研究熱點,為進一步探討FOXD3-AS1調控VSMCs生物學行為的分子機制,本研究采用生物信息學網站對FOXD3-AS1的靶基因進行預測,顯示miR-127-3p是FOXD3-AS1的潛在靶點。研究顯示miR-127-3p在連續注射阿霉素誘發的心臟功能障礙小鼠血漿中表達下調〔13〕。在腎臟缺血再灌注大鼠模型中,miR-127-3p是缺血后腎組織修復過程中HIF-1α的效應子〔14〕。此外,miR-127-3p在口腔鱗癌和上皮性卵巢癌中表達下調,過表達miR-127-3p可抑制體外腫瘤細胞的增殖、遷移和侵襲,是口腔鱗癌和上皮性卵巢癌的潛在治療靶標〔15,16〕。本研究結果提示,FOXD3-AS1通過調控miR-127-3p表達進而影響VSMCs的增殖、凋亡、遷移和侵襲。

PI3K/AKT信號通路在VSMCs的增殖、遷移和表型轉換中具有重要作用,其激活可促進血管重塑性疾病的發生〔17,18〕。本研究提示FOXD3-AS1靶向miR-127-3p對VSMCs的增殖、凋亡、遷移和侵襲的影響與調控PI3K/AKT信號通路有關。