水稻萌發耐淹性的遺傳分析

李 姍

（湖北大學，湖北 武漢 430062）

水稻在國計民生和農業生產方面有著重要的影響，是最普遍的農業經濟作物品種之一。水稻生長期間一旦發生水淹，會引起水稻缺氧，植株會通過厭氧呼吸來獲取氧份（養份）維持其基本的生理活動，同時會產生乙醇。若水稻植株長時間處于缺氧狀態，則會因產生過多的乙醇而中毒，造成稻秧植株組織潰敗，導致植株萎縮或死株等。缺氧在很大程度上還會加重水稻稻瘟病、立枯病的發生，是制約水稻生產的重要因素。

2019 年孫凱等人利用200 份來源廣泛的水稻種質為材料，在有氧環境下進行萌發試驗，測量種子萌發率、萌發指數和活力指數；在低氧條件下測量芽鞘長和芽鞘直徑；進行耐淹成苗試驗，測定耐淹成苗率。發現種子活力、芽鞘長與耐淹成苗率密切相關，可作為篩選高耐淹成苗水稻材料的重要性狀。進行了全基因組關聯分析、轉錄組分析與基因表達模式比較的聯合應用，可提高候選基因的篩選效率。分析了影響耐淹成苗率的關鍵表型性狀，挖掘相關的遺傳位點和候選基因[1]。2020 年王杰等人對水稻育種發展趨勢進行了分析，綜述了水稻耐淹水萌發表型的遺傳研究、基因鑒定、連鎖分子標記開發等工作，并指出了該領域應用研究的關鍵問題[2]。2021 年孫志廣等人對來自不同年代和地區的191 份粳稻種質資源進行了萌發耐淹性鑒定，共獲得12份萌發耐淹性強的種質資源，其中連粳15號表現出較強的低氧萌發能力。利用其與秈稻品種構建的分離群體，采用模擬大田的鑒定方法，在水稻1號、3號、9號、10號染色體上共檢測到4個QTL[3]。

雖然已有較多的水稻低溫萌發農藝性狀的研究報道，但針對耐淹萌發的表現和遺傳鑒定研究較少。本研究利用具有遺傳多樣性的種質資源構建自然群體，結合實驗采集、分析水稻遺傳數據，以期為選育耐淹品種、提高水稻產量提供依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本試驗以200 份常規粳稻為試驗材料，來自于東鄉野生導入系自然群體。

1.2 試驗試劑

本實驗所用試劑包括次氯酸鈉、無水乙醇、氫氧化鈉、乙二胺四乙酸、瓊脂糖、蛋白胨、酵母提取物、硼酸、氯化鎂、曲拉通、肌醇、蔗糖、葡萄糖、硝酸鉀、硫酸銨、硫酸鎂、硫酸銅、硫酸亞鐵、硫酸鋅、磷酸二氫鉀、鉬酸鈉、谷氨酰胺、脯氨酸、水解酪蛋白等。

實驗所用滅菌水為超純水，DNA 提取液采用EDTA 法配制。

1.3 試驗設備

電熱恒溫水浴鍋、電子天平、離心機、植物組織破碎儀、漩渦振蕩器、磁力攪拌器、pH 計、移液槍、PCR 儀、微波爐、電泳儀、電泳槽、恒溫搖床、光照培養箱、根系掃描儀。

1.4 試驗方法

1.4.1 種子萌發試驗

200份自然群體材料，每個材料設3 次生物學重復，每個重復內分2 次技術重復，每個技術重復取100粒種子，放置在鋪好的兩層中速定性濾紙的9 cm 直徑培養皿上，加10 mL 超純水，蓋上培養皿蓋子，放置在恒溫光照培養箱中培養7 d，培養箱內溫度設置為30℃，光照設置為光照8 h、無光照16 h。每隔24 h 測量記錄萌發種子個數持續7 d，第7 d 記錄未萌發種子數，測量萌發率、萌發勢、萌發指數和活力指數。

式中：Gt——第t天新萌發的正常幼苗數；Dt——萌發的天數。

1.4.2 淹水低氧萌發試驗

200份自然群體材料，每個材料設3 次生物學重復，每個重復內份4 次技術重復，每個技術重復取5 粒種子（篩選去除空粒、癟粒的種子），放置在50 mL 透明塑料離心管中，加滿超純水并蓋緊蓋子造成淹水低氧環境，放置在恒溫光照培養箱中培養6 d，培養箱內溫度設置為30℃，光照設置為光照8 h、無光照16 h。6 d 后用根系掃描儀測量芽鞘長度及芽鞘直徑。

1.4.3 遺傳圖譜構建/全基因組關聯分析

采用瓊脂糖凝膠電泳分析DNA 的純度和完整性，Nanodrop 檢測DNA純度，Qubit 進行濃度分析定量。

采用GWAS 專業分析軟件，采用混合線性模型，對群體結構和個體親緣關系進行校準，同時減少計算時間。并利用已經公布的SNP 數據，對不同群體的相關性狀進行關聯分析，查找出潛在的候選的基因點位。

1.4.4 篩選候選基因/關聯位點分析

如果某一個SNP 位點與表型性狀呈顯著關聯，那么就認為這個SNP 與表型數據存在協同變異關系。根據和水稻基因組注釋，查找與其相關的基因作為重要的候選基因。根據己發表的文章，查找己定位的QTL，查找在水稻中存在的同源基因。與GWAS 顯著峰值位點進行比對，查找到候選基因。

2 試驗結果與討論

2.1 水稻種子正常萌發表現

對200 份自然群體材料在正常條件下的10 個表型進行調查。其中萌發指數標準誤差最大，是0.681 5，正常苗干質量和正常根干質量標準誤差最小，是0.000 1；說明萌發指數的離散程度最大，品種間的差異也越大。正常根干質量變異系數最大，是0.393 4，萌發率變異系數最小，是0.051 6。

2.2 水稻種子水淹低氧萌發表現

低氧條件處理200 份自然群體材料，對群體材料的芽鞘長、芽鞘直徑、苗長、總根長、苗鮮質量、根鮮質量、苗干質量以及根干質量進行調查并進行統計分析。其中總根長標準誤差最大，是0.106 7，苗干質量和低氧根干質量最小，接近零說明低氧總根長的離散程度最大，品種間的差異也越大。根干質量變異系數最大，是0.457 6，芽鞘直徑變異系數最小，是0.073 2。

表1 正常萌發與水淹低氧萌發數據對比Tab.1 Comparison of normal germination and waterlogged hypoxic germination data

2.3 關聯位點分析

使用Plink 軟件，將等位基因頻率MAF＞0.05 和缺失率＜0.1作為閾值，對所選擇的200份自然群體材料的SNP數據進行篩選。群體分層分析主要分為群體進化樹分析和主成分分析，兩者的結果可以進行相互驗證[4，5]。距離矩陣采用TreeBest 軟件計算，采用鄰接法構建系統進化樹。引導值經過達1 000 次計算獲得；此群體主要可分為兩個亞群，第一個亞群共6個材料，另外一個亞群包括其他194材料。

利用200 份水稻自然群體品種進行簡化基因組測序，基因組大小為374424240bp，群體樣本平均比對率為96.17%，對基因組的平均測序深度為14.16X，平均覆蓋度為11.24%，至少有4 四個堿基的覆蓋度為5.99%。SAMTOOLS 軟件檢測共獲 得 了652 457 個SNP 位 點，經 過 條 件 為dp2、Miss0.9、Maf0.01 的過濾后，最后共獲得了161 657 個高質量的SNP 位點用于后續分析。對200份材料的耐淹苗干質量進行全基因組關聯分析，共檢測到了10 個與耐淹苗干質量相關的SNP位點，基于水稻基因組注釋，依據LD 衰退水平，本研究在關聯SNP 位點上下游區域，共檢測到227 個基因，對其中9 個與本研究相關的基因進行注釋。在關聯位點Chr01_35309315 附近找到了一個與WRKY24 轉錄因子相關的基因；在Chr08_20219220 位點附近找到了3 個基因，分別為編碼含CCHC 型結構域的鋅指蛋白基因，編碼含PHD 型結構域的鋅指蛋白基因以及編碼含CAH1 結構域碳酸酐酶基因；在Chr08_19427880 位點附近找到了4 個基因，分別是編碼乙醇脫氫酶基因，編碼亮氨酰-tRNA 合成酶基因和兩個編碼含PHD 型結構域的鋅指蛋白基因；在Chr12_10787959 位點附近找到了一個編碼熱休克蛋白DnaJ 的基因。

3 結論

對200 份水稻品種的萌發耐淹性檢測結果表明，水稻群體內耐淹萌發性狀存在廣泛的表型變異。主要成分分析說明水稻群體內部存在明顯的群體結構，這種結構對于關聯分析有著較強的影響。利用主要成分作為關聯分析的協變量，可以提高關聯分析的準確度。對200份材料的耐淹水稻干重進行全基因組關聯分析，共檢測到了10個與耐淹水稻干重相關的SNP 位點，基于水稻基因組注釋，通過LD 衰減水平，在的關聯SNP 位點上下游區域檢測到227 個基因，對其中9 個為關聯候選基因。在對更有代表性的核心種質進行評價時，發現粳稻萌發耐淹能力并不是單純的較強，而是表現出較大的差異，這不同于侯名語（2004）等人的研究，他們提出了粳稻和粳稻萌發耐淹能力不同，粳稻的萌發耐淹能力也不同，而且可能表現出較強的缺氧萌發能力[6]。這很可能是因為所選擇的實驗材料的差異。本研究結果還發現胚芽鞘長為2.0～2.3 cm 的種質資源占比最多，達到48.2%，群體變異率為27.9%這說明粳稻品種的萌發耐淹性存在著廣泛的遺傳變異，這與王洋等（2009）研究結果相一致[7]。在該研究中，發現了一個QTL位點控制兩個或多個性狀的現象，曾長英（2006）指出QTL 的“多效性”是指同一QTL 位點同時作用于兩個或多個數量性狀，并對多個性狀起調控作用[8]，而前期工作也證實了該現象。