肉制品中大腸埃希氏菌O157:H7實時熒光PCR檢測方法的研究

楊 滴

（大連市檢驗檢測認證技術服務中心，遼寧大連 116600）

大腸埃希氏菌O157:H7（E.coliO157:H7）是腸出血型大腸埃希氏菌的一種主要血清型，是一種危害嚴重的食源性病原微生物，其廣泛分布于自然界，嚴重威脅公眾健康[1-3]。近年來，由致病性微生物引起的食品污染事件呈上升趨勢。肉及肉制品營養豐富，可滿足人們的需求，但極易滋生各類有害細菌[4]。相關調查發現，肉及肉制品受致病菌的污染最為嚴重，而E.coliO157:H7 污染占比很大[5]。

現階段E.coliO157:H7 的主要檢驗方法為微生物分離培養鑒定，其過程煩瑣、費時費力、易產生假陽性[6]?；赥aqMan 探針的實時熒光PCR 技術是微生物檢驗的主要輔助手段，具有高效、特異、精準的優點。本研究旨在以E.coliO157:H7 菌體抗原基因rfbE為對象，研發一種肉制品中E.coliO157:H7實時PCR 檢測方法，為肉制品中E.coliO157:H7 的檢測提供技術支持，為市場監管提供保障。

1 材料與方法

1.1 菌株

本研究使用11 株標準菌株，均購于CICC。所有標準菌株信息見表1。

表1 標準菌株信息

1.2 主要試劑

營養肉湯培養基；細菌基因組DNA 提取試劑盒；Premix Ex Taq PCR 試劑盒。

1.3 主要儀器

ABI QS7 Flex 熒光定量PCR 儀；超低溫離心機；DNA 分析儀。

1.4 實驗方法

1.4.1 引物與探針

根據E.coliO157:H7 菌體抗原基因rfbE序列，使用Primer express 3.0 軟件設計特異性引物和TaqMan MGB 探針，引物探針由上海生工公司合成，引物及探針序列見表2。

表2 實時熒光PCR 引物及探針序列

1.4.2 DNA 模板制備

將E.coliO157:H7 和其他10 株標準菌株接種于營養肉湯培養基，36 ℃培養24 h。取100 μL 增菌液，提取DNA 作為實時熒光PCR 模板。

1.4.3 實時PCR 的反應體系及條件

實時熒光PCR 擴增采用20 μL 反應體系，具體各種試劑濃度、體積見表3。

表3 實時熒光PCR 擴增反應體系

實時熒光PCR 反應程序參考試劑盒說明書為95 ℃預變性30 s，然后進入循環反應，即95 ℃變性5 s、60 ℃退火和延伸30 s，共40 個循環。

1.4.4 特異性研究

將E.coliO157:H7 等11 株標準菌株按照1.4.2制備DNA 模板，并用無菌水作為無模板對照，實時熒光PCR 反應體系和條件按優化結果設置，驗證實時熒光PCR 檢測E.coliO157:H7 的特異性。

1.4.5 靈敏性研究

將E.coliO157:H7 標準菌株增菌液進行倍比梯度稀釋，形成梯度含菌量為1×106CFU·mL-1至1×101CFU·mL-1的6 個濃度的菌懸液。每個稀釋度取1 mL 菌懸液，按照1.4.2 制備DNA，探討實時熒光PCR 檢測E.coliO157:H7 的靈敏性。

1.4.6 實際樣品檢測

選取市售鮮豬肉、鮮牛肉、鮮羊肉、雞胸肉、烤鴨、熟豬頭肉、醬牛肉、牛肉干、醬豬耳和醬牛蹄筋共10 個樣品，分別取上述樣品25 g 放入裝有225 mL營養肉湯的培養基中，于36 ℃培養箱培養24 h。取增菌液1 mL 提取DNA 后，進行實時PCR 反應，探討本研究的實用性。

2 結果與分析

2.1 特異性結果

本試驗以CICC 10907E.coliO157:H7 為目標菌株，以金黃色葡萄球菌、鼠傷寒沙門氏菌等10 株標準菌株為非目標菌株，高純水為無模板對照，驗證實時熒光PCR 法檢測大腸埃希氏菌O157:H7 的特異性。擴增結果見圖1，只有目標菌株具有擴增曲線，其他10 株非目標菌株無擴增曲線。結果表明，本研究建立的實時熒光PCR 檢測法具有較強的特異性。

圖1 實時熒光PCR 檢測大腸埃希氏菌O157:H7 特異性試驗

2.2 靈敏性結果

分別吸取1×106CFU·mL-1、1×105CFU·mL-1、1×104CFU·mL-1、1×103CFU·mL-1、1×102CFU·mL-1和1×101CFU·mL-1的E.coliO157:H7 菌懸液1 mL 進行DNA 提取，提取的DNA 進行實時熒光PCR 試驗。E.coliO157:H7 靈敏性試驗結果見圖2。結果顯示，大腸埃希氏菌O157:H7 濃度為1×106CFU·mL-1、1×105CFU·mL-1、1×104CFU·mL-1、1×103CFU·mL-1、1×102CFU·mL-1時均有擴增曲線濃度低于1×102CFU·mL-1時無擴增曲線，該方法檢測的低限為1×102CFU·mL-1。

圖2 實時熒光PCR 檢測大腸埃希氏菌O157:H7 靈敏性試驗

2.3 實際樣品檢測結果

對鮮豬肉、鮮牛肉、鮮羊肉、雞胸肉、烤鴨、熟豬頭肉、醬牛肉、牛肉干、醬豬耳、醬牛蹄筋共10 個樣品的營養肉湯增菌液進行DNA 提取，以大腸埃希氏菌O157:H7 為陽性對照，進行實時熒光PCR試驗，擴增結果見圖3。結果顯示，鮮豬肉、鮮牛肉、鮮羊肉中檢測出含有E.coliO157:H7。

圖3 實時熒光PCR 檢測實際樣品試驗

3 結論與討論

研發一種靈敏度高、特異性強的快速檢測技術已經成為當今社會中肉與肉制品安全監測發展的必然趨勢[7]。長期以來，肉制品中大腸埃希氏菌O157:H7 檢測主要依據細菌培養、生化鑒定，該方法步驟煩瑣，且耗時長。實時熒光PCR 技術具有靈敏度高、重復性好、反應高效、準確性高、檢測周期短等優點[8]，已廣泛應用于分子生物學和醫學研究等領域[9]。本研究以rfbE基因為目標基因，通過反復摸索，建立了一種特異性強、靈敏性高、切實可行的檢測肉制品中大腸埃希氏菌O157:H7 的實時熒光PCR 方法。本研究設計含有不同濃度的大腸埃希氏菌O157:H7（1×106CFU·mL-1、1×105CFU·mL-1、1×104CFU·mL-1、1×103CFU·mL-1和1×102CFU·mL-1）菌液樣品，試驗得到該檢測方法的低限為1×102CFU·mL-1。本檢測方法具有特異、快速的特點，能夠滿足檢測要求，為肉制品中大腸埃希氏菌O157:H7 的快速檢測奠定了基礎。