大米中內源性香蘭素的研究

陳仁熙，孫瑩瑩，王玉晶，張秀芹

（華測檢測認證集團股份有限公司，廣東深圳 518101）

香蘭素（Vanillin），又名香草醛、3-甲氧基-4-羥基苯甲醛，是一種應用廣泛的食品添加劑和飼料添加劑，在醫藥、化妝品等行業也有廣泛應用[1-3]。天然香蘭素是從香莢蘭豆中提取，其安全性得到原國家食品藥品監督管理總局、美國食品藥品監督管理局、歐洲食品安全局和聯合國糧農組織/世界衛生組織食品添加劑聯合專家委員會等多個國內外機構的認可，但由于天然產品價格昂貴，目前使用的多為合成產品。目前全球對香蘭素的年需求量約為20 000 t，我國2010 年消耗2 000 多噸，約80%用于食品，10%左右用于飼料[4-5]。過多攝入香蘭素會導致頭暈、惡心、呼吸困難甚至肝腎損傷，對人體存在一定的危害[6]。糧食及農業組織和世界衛生組織食品添加劑聯合專家委員會限制香蘭素的每日攝入量應低于10 mg·kg-1。在食品工業領域，我國規定香蘭素、香莢蘭豆浸膏（提取物）等作為食品用香料使用，但對于某些特殊食品，如大米、巴氏殺菌乳、奶油、新鮮水果、鮮肉、鮮蛋、蜂蜜和飲用純凈水等，不得使用食品類香料、香精。近年來，我國食品風險監測管理中，一旦發現上述食品檢出香蘭素，即判為高風險產品。

但隨著國內外研究的深入，多項研究表明除了香莢蘭豆中含有天然香蘭素，其他如水稻秸稈、米糠及一些果殼中也存在香蘭素，可見，大米中可能存在內源性香蘭素。因此，明確大米中是否含有內源性香蘭素，對于監管部門和大米的生產經營者十分必要。

本研究利用國家現有的檢測方法，《食品中香蘭素、甲基香蘭素和乙基香蘭素的測定》（BJS 201705）中的高效液相色譜-串聯質譜法，對從市場隨機購買的來自不同產區的203 份大米進行摸底檢測，并對產自國內的10 份水稻樣品進行了檢測，對香蘭素的含量及來源進行了簡要分析，以期為政府監管政策的調整提供一定的數據支撐。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

實驗檢測的大米樣品均為隨機購買市售產品，合計203 批大米試樣（市售，預包裝食品）；10 份稻谷來源于東北產區的種植戶。

香蘭素標準品（Lot：ALT077120；Purity：99.0%；first standard；CAS：121-33-5）； 乙基香蘭素標準品（Lot：FS1611737；Purity：99.2%；first standard；CAS：120-14-9）；甲醇、乙腈、正己烷（色譜純，MERCK）；甲酸（色譜純，THERMO FISHER）；氯化鈉（在550 ℃灼燒4 h 后備用）；水為超純水（電阻率=18.2 MΩ·cm）。

1.2 儀器與設備

液相色譜-串聯質譜儀（ESI 源，TSQ Endura，Thermo）；渦旋混合器（VORTEX 3，德國艾卡）；超聲波清洗儀（KMH1-240W，GT SONIC）；離心機（H1850R，湘儀）；分析天平（感量0.1 mg 和0.01 g，ME204E，METILER TOLEDO）。

1.3 實驗方法

1.3.1 標準溶液配制

稱取香蘭素、乙基香蘭素標準品各10 mg，精密稱定，加甲醇適量使其溶解并定容至10 mL 容量瓶，配制成1 mg·mL-1的標準儲備液；分別精密量取香蘭素、乙基香蘭素標準儲備液各1 mL 于100 mL容量瓶，用甲醇稀釋至刻度，配制成10 μg·mL-1混合標準工作液；分別精密量取10 μg·mL-1混合標準工作液1 mL 和100 μL 于10 mL 容量瓶，用甲醇稀釋至刻度，配制成1 000 μg·L-1和100 μg·L-1的混合標準工作液；準確移取100 μg·L-1混合標準工作液50 μL、100 μL，以及1 000 μg·L-1混合標準工作液20 μL、40 μL、80 μL、100 μL，加入適量甲醇將其稀釋為5 μg·L-1、10 μg·L-1、20 μg·L-1、40 μg·L-1、80 μg·L-1和100 μg·L-1系列標準溶液，以繪制標準曲線。

1.3.2 前處理方法

稱取（1±0.01）g 樣品（大米和米糠），置于50 mL 聚丙烯離心管中，加入3 mL 水，渦旋振蕩30 s，加入7 mL 乙腈，渦旋振蕩30 s，超聲處理25 min，10 000 r·min-1離心5 min 后，取上層清液過0.22 μm濾膜，待分析。

1.3.3 儀器條件

（1）色譜條件。色譜柱：Waters Xbridge C18柱（2.1 mm×100 mm，2.5 μm）；流動相：A 相為0.1%甲酸水溶液，B 相為甲醇，梯度洗脫條件見表1；流速：0.3 mL·min-1；柱溫：40 ℃；進樣量：5 μL。

表1 梯度洗脫條件

（2）質譜條件。電噴霧離子源（Electron Spray Ionization，ESI），正離子掃描，多反應監測（Multiple Reaction Monitoring，MRM）模式； 干燥氣為氮氣，溫度為350 ℃；霧化氣為氮氣，霧化器壓力為10 psi；毛細管電壓：5 500 V；待測化合物定性、定量離子對及碰撞能量、去簇電壓等參數見表2。

表2 香蘭素的定性、定量離子對及碰撞能量、去簇電壓參數

2 結果與分析

2.1 標準曲線線性、檢出限及回收率

根據《實驗室質量控制規范 食品理化檢測》（GB/T 27404—2008）的要求，線性相關系數r應＞0.99、回收率應在60%～120%、精密度方面相對標準偏差RSD 應＜21%。由表3 可知，香蘭素和乙基香蘭素均在5 ～100 μg·L-1呈良好的線性關系，且相關系數均＞0.99。對同一陰性大米樣品進行檢出限水平重復加標測定以驗證方法回收率和精密度（n=6）。香蘭素回收率為95.15%，相對標準偏差為2.5%；乙基香蘭素回收率為82.98%，相對標準偏差為1.5%。回收率和精密度均滿足GB/T 27404—2008 的要求。

表3 大米中香蘭素檢測方法的回收率、曲線及檢出限

2.2 大米及稻谷樣品測定結果

隨機購買的203 份大米中198 份檢出香蘭素，含量多在100 ～250 μg·kg-1，詳見表4。10 批稻谷脫殼后，分別對米糠及米進行檢測，結果全部檢出香蘭素，米中香蘭素含量在217.04 ～456.23 μg·kg-1，米糠中香蘭素含量在5 710.91 ～18 470.62 μg·kg-1，詳見表5。

表4 203 批大米樣品的香蘭素檢出量

表5 稻谷樣品不同部位的香蘭素檢出量對比

2.3 內源性分析

《食品安全國家標準 食品添加劑使用標準》（GB 2760—2014）規定大米中不得添加香蘭素，即檢出值達到方法定量意味著該產品不符合要求。本研究中檢測的203 批大米中有158 批檢測值超100 μg·kg-1，不符合率為76.9%。由于樣品是隨機購入并分別來源于廣東、安徽、江蘇、廣西、越南、巴基斯坦及柬埔寨等多個產地，同時非法添加的可能性不大，內源性可能性更大。

從表4、表5 可以看出，市場隨機購入的預包裝大米香蘭素含量差異較大；米糠中香蘭素含量遠遠高于米內含量；新脫殼的米中香蘭素含量均高于200 μg·kg-1。可能原因為香蘭素具有揮發性，其揮發量受保存時間和保存環境的影響，導致其香蘭素檢出量存在差異；香蘭素含量和大米品種密切相關，有研究表明，不同品種的大米香蘭素含量存在差異。

有研究表明，米糠中含有大量的香蘭素前體物質阿魏酸，阿魏酸的C-C 雙鍵結構在氧化后即可成為香蘭素或通過生物轉化形成香蘭素。香蘭素的醛基氧化后即可成為香草酸，阿魏酸、香蘭素和香草酸之間具有依次轉化關系。嚴娜等[7]研究表明有色米中含有香草酸（香蘭素氧化產物）、阿魏酸及沒食子酸等，香草酸含量在9.5 ～110.3 mg·kg-1，阿魏酸含量在27.3 ～84.6 mg·kg-1。

3 結論

根據研究結果，初步判斷大米含內源性香蘭素的可能性較大。但目前我國規定的檢測方法BJS 201705為高效液相色譜串聯質譜法，無法分辯內源和外源。建議相關人員加大研究力度，充分論證大米中是否含內源性香蘭素，如果存在內源性問題，應及早調整相應的國家標準及監管措施。