超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定配制酒中甜蜜素的含量

劉 慧，張嘯怡，何青科，徐文泱

（湖南省產(chǎn)商品質(zhì)量檢驗研究院，食品安全監(jiān)測與預(yù)警湖南省重點實驗室，湖南長沙 410017）

甜蜜素（環(huán)己基氨基磺酸鈉）是一種以環(huán)己胺為原料，經(jīng)氯磺酸或氨基磺酸化形成環(huán)己基氨基酸磺酸后與氫氧化鈉作用而制成的人工合成甜味劑，其甜度是蔗糖的30 ～80 倍，常在配制酒、冷凍飲品、腌漬蔬菜、餅干、飲料、糕點、蜜餞和復(fù)合調(diào)味料等食品中添加使用。人體不吸收甜蜜素，幾乎全部以原型經(jīng)糞便排出，在體內(nèi)不蓄積[1]。

配制酒通常以發(fā)酵酒或蒸餾酒及食用酒精為酒基，加入可食用動植物組織或既是食品又是中藥材的物質(zhì)，輔加食品添加劑用于呈色呈味。由于甜蜜素具有較好的改善配制酒風(fēng)味和口感的作用，部分配制酒生產(chǎn)者在實際生產(chǎn)過程中通常會添加一定量的甜蜜素以調(diào)整配制酒的適口性。《食品安全國家標準 食品添加劑使用標準》（GB 2760—2014）[2]規(guī)定，配制酒中甜蜜素的最大使用量為0.65 g·kg-1（以環(huán)己基氨基磺酸計）。臨床實踐表明，長期或過量攝入甜蜜素，尤其是此類合成甜味劑，會對人體的代謝系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)等造成影響[3-4]。聯(lián)合國糧農(nóng)組織和世界衛(wèi)生組織食品添加劑聯(lián)合專家委員會建議其每日容許攝入量為0 ～11 mg·（kg bw）-1。

目前，測定食品中甜蜜素的檢測方法主要包括分光光度法[5]、液相色譜法（LC）[6]、氣相色譜法[7-8]、離子色譜法[9]、氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法[10-11]和液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法[12-14]。對于配制酒中甜蜜素測定的現(xiàn)行有效的食品安全國家標準方法為GB 5009.97—2016 第二法 高效液相色譜法[15]，該方法通過衍生化將環(huán)己基氨基磺酸鈉水提后，在強酸性溶液中與次氯酸鈉反應(yīng)，生成N,N-二氯環(huán)己胺，經(jīng)正庚烷萃取，利用高效液相色譜法檢測，操作煩瑣，定量限為0.030 g·kg-1，易出現(xiàn)“假陰性”結(jié)果。

由于超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法具有快速分離、靈敏度高、選擇性高的優(yōu)勢，已廣泛應(yīng)用于白酒、飲料、糕點和面制品中甜蜜素的測定。本文以配制酒和甜蜜素為研究對象和目標，開展相關(guān)方法學(xué)考察，建立配制酒中甜蜜素的測定方法。通過實際樣品測定，比較本方法和GB 5009.97—2016 高效液相色譜法二者測定結(jié)果的差異，為實現(xiàn)開發(fā)配制酒中甜蜜素簡便、快速、準確、靈敏的液質(zhì)聯(lián)用檢測方法提供研究基礎(chǔ)，為打擊配制酒中甜蜜素超量使用等違法違規(guī)行為提供檢驗依據(jù)，以滿足食品安全監(jiān)管需求。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

配制酒樣品23 批次，來源于湖南省流通和生產(chǎn)領(lǐng)域的監(jiān)督抽查；環(huán)己基氨基磺酸鈉標準品，C6H11NHSO3Na，CAS：139-05-9，純度≥99.9%，0.25 g，DR；甲醇，色譜純，上海安譜實驗科技股份有限公司；乙酸銨，色譜純，阿拉丁生化科技股份有限公司；超純水采用Milli-Q 制備（18.2 MΩ·cm）。

Thermoscientific Vanquish+TSQ QUANTIS 超高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀；Sartorius SECURA225D-1CN 分析天平。

1.2 溶液的配制

（1）標準儲備液。準確稱取11.2 mg 環(huán)己基氨基磺酸鈉用水溶解定容至10 mL，搖勻，制成濃度為1.0 mg·mL-1的標準溶液。

（2）標準中間液。吸取上述標準儲備液適量，用水溶解定容至10 mL，搖勻，制成濃度為1.0 μg·mL-1的標準中間液。

（3）標準曲線系列工作液。吸取上述標準中間液適量，用水逐級稀釋制成5 ng·mL-1、10 ng·mL-1、20 ng·mL-1、50 ng·mL-1、100 ng·mL-1、200 ng·mL-1和500 ng·mL-1標準系列溶液。

1.3 樣品前處理

稱取樣品1.0 g 置于100 mL 比色管中，加水稀釋至刻度，搖勻，過0.22 μm 濾膜，待測。

1.4 儀器條件

1.4.1 液相色譜條件

色譜柱：Hypersil GOLD C18（150 mm×2.1 mm，3 μm）； 柱溫：30 ℃ ； 進樣量：5 μL； 流速：0.2 mL·min-1；流動相：10 mmol·L-1乙酸銨（A）和甲醇（B），梯度洗脫條件見表1。

表1 流動相梯度洗脫條件

1.4.2 質(zhì)譜條件掃描方式：正離子掃描（ESI-）；毛細管電壓：2 500 V；鞘氣流速：20 Arb；輔助氣流速：5 Arb；離子傳輸管溫度：325 ℃；離子源溫度：350 ℃；掃描方式：多反應(yīng)離子監(jiān)測（MRM），條件見表2。

表2 甜蜜素多反應(yīng)離子監(jiān)測條件

2 結(jié)果與分析

2.1 試驗條件優(yōu)化

2.1.1 樣品前處理

配制酒的酒基為蒸餾酒及食用酒精或發(fā)酵酒，因此配制酒中含有一定濃度的乙醇。根據(jù)白酒中甜蜜素分析方法前處理過程需于60 ℃水浴加熱30 min去除酒精，考慮配制酒中乙醇含量對測定結(jié)果的影響，本試驗比較揮發(fā)樣品中乙醇（60 ℃水浴上加熱30 min）與直接用水稀釋兩種前處理方式對甜蜜素測定結(jié)果的影響，結(jié)果見表3。3 個濃度水平兩種前處理方式的測定結(jié)果相對偏差為-12.2%～5.0%，無明顯差別，可能是因為配制酒不同于高乙醇含量的白酒，其乙醇濃度偏低，用水稀釋后，乙醇對測定結(jié)果的影響可忽略不計。直接稀釋處理進樣快速、簡便，因此，本試驗選擇直接用水稀釋進樣分析。

表3 兩種前處理方法甜蜜素含量測定結(jié)果

2.1.2 色譜與質(zhì)譜條件

由于甜蜜素（環(huán)己基氨基磺酸鈉）以鈉鹽形式存在，在水溶液中易電離形成[M-Na]-，適合負離子模式進行檢測。ESI 離子化過程主要受化合物濃度、表面活性、基質(zhì)（溶劑）性質(zhì)、pH 值以及流速的影響，在流動相中添加適當(dāng)?shù)母男詣┤缂姿帷彼⒁宜徜@，有助于提高化合物離子化效率和改善峰型。負離子模式下，乙酸銨、氨水更容易奪取溶劑中的H+，從而促使甜蜜素從分子態(tài)向離子態(tài)的轉(zhuǎn)化，提高電離效率。但考慮到氨水對色譜柱的損傷，本試驗采用乙酸銨作為改性劑，通過比較5 mmol·L-1、10 mmol·L-1、15 mmol·L-1乙酸銨溶液對響應(yīng)和峰形的影響發(fā)現(xiàn)，在10 mmol·L-1乙酸銨甜蜜素響應(yīng)好且峰形佳，因此最終采用10 mmol·L-1乙酸銨水溶液作為流動相。

2.2 方法學(xué)驗證

2.2.1 專屬性

按上述過程制備配制酒樣品、配制酒樣品中加入標準溶液的基質(zhì)加標樣品，吸取空白溶劑、標準溶液、樣品溶液和基質(zhì)加標溶液進樣分析，色譜圖見圖1。樣品溶液與基質(zhì)加標溶液色譜在甜蜜素峰位有相同的色譜峰出現(xiàn)，而空白溶液在相應(yīng)位置上無其他干擾峰，方法專屬性良好。

2.2.2 標準曲線

取1.2 項下標準曲線系列工作液，按上述條件測定，以甜蜜素峰面積為縱坐標、濃度為橫坐標繪制標準曲線，得出甜蜜素線性方程為y=7.886×103x-2.631×104（r2=0.999 1），甜蜜素在5 ～500 ng·mL-1線性關(guān)系良好。

2.2.3 檢出限和定量限

將標準溶液稀釋至適當(dāng)濃度，按1.3 項下制備適當(dāng)濃度的基質(zhì)加標樣品溶液，以S/N=3 和S/N=10 分別計算儀器和方法的檢出限和定量限，甜蜜素的儀器檢出限和定量限分別為0.15 ng·mL-1和0.3 ng·mL-1，方法檢出限和定量限分別為0.01 mg·kg-1和0.05 mg·kg-1。

2.2.4 準確度試驗

取配制酒樣品（甜蜜素含量為13.5 mg·kg-1），在樣品中添加低、中、高3 個水平濃度的甜蜜素標準溶液，每個水平6 份，按上述方法進行處理，計算甜蜜素回收率和相對標準偏差，結(jié)果見表4。甜蜜素在2.5 ～10.0 mg·kg-1添加水平下，回收率為99.0%～100.6%，相對標準偏差為0.8%～1.6%，表明該方法準確可靠，可滿足分析方法要求。

表4 甜蜜素回收率試驗結(jié)果

2.2.5 精密度試驗

取配制酒陽性樣品（甜蜜素含量為55.6 mg·kg-1），按1.3 項處理，重復(fù)測定6 次，測定結(jié)果分別為57.6 mg·kg-1、56.9 mg·kg-1、57.0 mg·kg-1、55.6 mg·kg-1、56.5 mg·kg-1和55.5 mg·kg-1，相對平均偏差為1.5%，相對誤差為1.6%，表明方法重復(fù)性良好。

2.2.6 稀釋穩(wěn)定性

取配制酒樣品，添加甜蜜素標準溶液制成甜蜜素含量為100 mg·kg-1的樣品溶液，按前處理過程進行處理，將處理的樣品溶液分別稀釋10 倍和100 倍，每個稀釋度6 份，測定，計算相對平均偏差和相對誤差，稀釋10倍和100倍的相對平均偏差分別為2.6%和3.2%；相對誤差分別為-0.3%和-1.3%，表明超線性范圍濃度的樣品，可通過對樣品進行一定程度的稀釋，此稀釋過程穩(wěn)定，不影響結(jié)果的準確性。

2.3 樣品測定

將流通領(lǐng)域抽查的23 份配制酒樣品按已建立的方法進行測定分析，并與GB 5009.97—2016 第二法測定結(jié)果進行比較，結(jié)果見表5。

表5 本方法與GB 5009.97—2016 第二法關(guān)于23 批配制酒中甜蜜素含量測定結(jié)果的比較

本方法共18份樣品檢出甜蜜素，含量為0.002 18～0.499 00 g·kg-1；GB 5009.97—2016 第二法共12 份樣品檢出甜蜜素，含量為0.030 8 ～0.511 0 g·kg-1。6 份樣品本方法有檢出，GB 5009.97—2016 第二法未檢出；5 份樣品兩種方法均未檢出，12 份樣品兩種方法均檢出，相對偏差為-9.7%～5.7%。所測定的配制酒樣品中甜蜜素含量結(jié)果均≤0.65 g·kg-1（以環(huán)己基氨基磺酸計），符合GB 2760—2014 使用限量要求。

3 結(jié)論

本文建立了配制酒中甜蜜素含量的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定方法，并開展方法學(xué)考察以驗證方法的可靠性。通過實際樣品測定，比較本方法和GB 5009.97—2016 高效液相色譜法二者測定結(jié)果的差異，對于均檢出甜蜜素的樣品兩種方法結(jié)果相對偏差＜15%，部分高效液相色譜法未檢出的樣品，本方法有檢出，在一定程度可避免“假陰性”結(jié)果。該方法簡便、快速、準確、靈敏，可為打擊配制酒中甜蜜素超量使用等違法違規(guī)行為提供檢驗依據(jù)，以滿足食品安全監(jiān)管需求。