液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定蜂蜜中雷公藤甲素的不確定度評定

曾 輝，鄧 楠，劉 川，王朝霞，尹芳平，袁 圓

（長沙市食品藥品檢驗所，國家酒類產(chǎn)品質(zhì)量檢驗檢測中心，湖南長沙 410000）

在我國云南、廣西等南方省份，多次發(fā)生食用蜂蜜中毒事件[1]。據(jù)文獻報道，在1972—2016 年，中毒374 人以上，死亡58 人。有毒的蜜粉源主要有雷公藤、博落回、鉤吻等，而能確定有毒蜜粉源植物名稱或清楚中毒化學(xué)成分的事件未達到1/3，對中毒來源難以追溯[2]。根據(jù)2016 年湖北和福建蜂蜜中毒死亡事件的調(diào)查，造成致死的有毒蜜源主要是雷公藤和昆明山海棠中的雷公藤甲素[3-4]。人類食用毒蜜后對肝、腎、生殖器官及免疫系統(tǒng)有一定損傷[5-6]。

雷公藤甲素是從雷公藤和昆明山海棠中分離得到的主要活性成分，為二萜類化合物，分子式為C20H24O6，呈白色針狀晶體，在水中難以溶解，而在甲醇、乙酸乙酯、氯仿等有機溶劑中容易溶解。根據(jù)《蜂蜜中雷公藤甲素的測定》（BJS 202108）用液相色譜-串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜測得其含量只是被測量的估計值，測量過程中的隨機效應(yīng)及系統(tǒng)效應(yīng)均會導(dǎo)致測量不確定度[7]。目前，關(guān)于測定蜂蜜中雷公藤甲素的含量還沒有不確定度評定的報道，為得到可靠的實驗數(shù)據(jù)，本文對實驗過程中的不確定度來源進行分析和評定，從而提高檢測檢驗質(zhì)量。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

自制陽性蜂蜜（市售蜂蜜加入雷公藤甲素）；雷公藤甲素標準品（純度99.6%），中國食品藥品檢定研究院；甲醇（色譜純），默克化工技術(shù)有限公司；甲酸（色譜純）、乙酸乙酯（分析純），國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

ME204E 萬分之一分析天平（感量0.000 1 g）、XS205DU 十萬分之一分析天平（感量0.000 01 g），梅特勒-托利多儀器有限公司；1290-6470 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀、SB-C18柱，安捷倫科技有限公司；TurboVap LV 氮吹儀，Biotage；X1R 離心機，賽默飛世爾科技有限公司；Fotector-06 全自動固相萃取儀，睿科集團（廈門）股份有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 標準溶液的配制

（1）雷公藤甲素標準儲備液（1.00 g·L-1）的配制。準確稱取10.00 mg 雷公藤甲素標準品于容量瓶中，用甲醇溶解并定容至10 mL。

（2）雷公藤甲素標準中間液（1.00 mg·L-1）的配制。準確量取100 μL雷公藤甲素標準儲備液于容量瓶中，用甲醇稀釋定容至100 mL。

（3）雷公藤甲素標準工作溶液的配制。準確量取雷公藤甲素標準中間液用空白樣品基質(zhì)稀釋，分別配制成2 μg·L-1、5 μg·L-1、10 μg·L-1、25 μg·L-1、50 μg·L-1和80 μg·L-1的基質(zhì)標準工作溶液。基質(zhì)標準工作曲線以基質(zhì)標準工作溶液濃度為橫坐標，縱坐標為峰面積繪制。

1.3.2 樣品處理

稱取2 g蜂蜜（精確至0.1 mg）于50 mL離心管中，加入4 mL 水與蜂蜜混勻，加入15 mL 乙酸乙酯渦旋振蕩5 min 再超聲10 min 提取，高速離心5 min，取上清液。再加入15 mL 乙酸乙酯提取1 次，合并兩次提取的上層有機溶劑，旋轉(zhuǎn)蒸干后用2 mL 乙酸乙酯溶解，過PSA 固相萃取柱，用5 mL 乙酸乙酯洗脫，收集洗脫液氮氣吹干。準確量取1 mL 甲醇溶液復(fù)溶，過濾后供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定[8]。

1.3.3 儀器條件

（1）色譜條件。色譜柱：SB-C18柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）；流速：0.3 mL·min-1；柱溫：20 ℃；進樣量：5 μL；流動相A 為0.1%甲酸溶液，流動相B 為甲醇；梯度洗脫：0 ～0.50 min，90%A；0.50 ～4.00 min，90%A→5%A；4.00 ～6.00 min，5%A→3%A；6.00 ～6.50 min，3%A；6.50 ～7.00 min，3%A→90%A；7.00 ～10.00 min，90%A。

（2）質(zhì)譜條件。離子源：電噴霧離子源；檢測方式：多反應(yīng)模式；掃描方式：正離子模式掃描；離子對：361.1/127（定量離子對），361.1/105.2，361.1/141.2；碎裂電壓：145 eV；碰撞能量：80 eV。

1.3.4 數(shù)學(xué)模型

雷公藤甲素含量的計算公式為

式中：X為試樣中雷公藤甲素的含量，μg·kg-1；ρ為由標準曲線得出的被測組分溶液質(zhì)量濃度，μg·L-1；V為定容體積，mL；f為稀釋倍數(shù)；m為試樣質(zhì)量，g；1 000 為換算系數(shù)[9]。

2 結(jié)果與分析

2.1 不確定度來源

測定蜂蜜中雷公藤甲素的不確定度主要來源于標準溶液配制、標準工作曲線制備、樣品溶液配制、樣品測定重復(fù)性和樣品加標回收率幾個方面。

2.2 不確定度計算

2.2.1 標準溶液配制引入的不確定度urel(r)

（1）標準品純度引入的不確定度urel(r1)。根據(jù)雷公藤甲素標準品的證書，其純度為99.6%，標準偏差為0.4%，按矩形分布，其標準不確定度為，相對標準不確定度為

（2）標準品稱量引入的不確定度urel(r2)。根據(jù)天平的檢定證書和《電子天平檢定規(guī)程》（JJG 1036—2008），十萬分之一天平稱量范圍為m＜20 g 時，U=0.000 03 g，k=2，稱量過程包含去皮、稱重兩個步驟，故稱取雷公藤甲素標準品0.010 25 g，則

（3）標準品定容引入的不確定度urel(r3)。標準品定容引入的不確定度主要來源于溶劑的膨脹系數(shù)、玻璃量器的允許誤差[10]。配制標準品的溶液為甲醇，甲醇的膨脹系數(shù)為0.001 19 ℃-1，實驗室溫度為（20±5）℃，故溫度偏差產(chǎn)生的溶劑體積增量為10×0.001 19×5=0.059 5 mL，按照均勻分布，包含因子則按照JJG 196—2006 和檢定證書，10 mL 容量瓶（A 級）U=0.006 mL，則

則配制雷公藤甲素標準儲備液引入的相對不確定度為

（4）標準溶液稀釋引入的不確定度urel(r4)。根據(jù)檢定證書和檢定規(guī)程，10 ～100 μL 移液器的最大允許誤差為±2%，按矩形分布計算，重復(fù)度最大允許誤差為1%，則。溶劑因溫度造成的膨脹系數(shù)引入的誤差為

故移液器引入的相對標準不確定度為

100 mL 容量瓶用甲醇定容，因溫度產(chǎn)生的不確定度為

100 mL 的容量瓶（A 級）U=0.03 mL，則

則容量瓶引入的相對標準不確定度為

標準溶液稀釋引入的相對標準不確定度為

因此，由標準品引入的相對標準不確定度為

2.2.2 標準工作曲線制備引入的相對不確定度urel(v)

（1）配制標準工作曲線引入的不確定度urel(v1)。分別用10 ～100 μL 和100 ～1 000 μL 移液器移取標準品中間液20 μL、50 μL、100 μL、250 μL、500 μL和800 μL 置于10 mL 容量瓶中，用空白樣品基質(zhì)稀釋定容至刻度。空白樣品基質(zhì)為甲醇溶液，膨脹系數(shù)為0.000 699 ℃-1。配制標準工作曲線過程中玻璃容器和移液器引入的不確定度詳見表1。

表1 配制標準工作曲線引入的不確定度

（2）標準工作曲線擬合引入的不確定度urel(v2)。標準工作曲線測3 次，按照外標法擬合，得到線性方程為Y=66.780 168 73X-5.129 430 26，其相關(guān)系數(shù)R2=0.997 1，標準系列工作溶液峰面積的標準偏差為

標準系列工作溶液的相對標準不確定度為

標準曲線引入的不確定度見表2。

表2 標準工作曲線擬合引入的不確定度

2.2.3 樣品溶液配制引入的不確定度urel(m)

（1）試樣稱量引入的不確定度urel(m1)。根據(jù)天平的檢定證書和檢定規(guī)程，萬分之一的分析天平U=0.000 3 g，k=2，樣品重復(fù)稱量7 次，平均值為2.072 0 g，故相對標準不確定度為

（2）樣品定容體積引入的不確定度urel(m2)。樣品用1 mL 甲醇溶液復(fù)溶，按照均勻分布，包含因子則按照檢定證書和檢定規(guī)程，100 ～1 000 μL 的移液器最大允許誤差為1%，則0.005 77 mL，重復(fù)度最大允許誤差為0.5%，則樣品定容體積引入的相對標準不確定度為

樣品溶液配制引入的相對合成不確定度為

2.2.4 樣品測量重復(fù)性引入的不確定度urel(s)

對同一樣品取7 平行，測得樣品含量分別為0.998 7 μg·kg-1、0.972 5 μg·kg-1、1.010 1 μg·kg-1、0.987 7 μg·kg-1、1.076 0 μg·kg-1、1.005 3 μg·kg-1和1.010 5 μg·kg-1，平均值為1.008 7 μg·kg-1，標準偏差為S=0.032 7，urel(s)=0.012 2。

2.2.5 樣品的加標回收率引入的不確定度urel(f)

稱取樣品2 g，添加3 μg·kg-1雷公藤甲素標準品，測得回收率分別為95.56%、95.82%、96.03%、97.49%、99.74%、104.23% 和100.22%，平均值為98.44%，回收率的標準偏差為回收率的相對標準不確定度為

2.3 合成相對標準不確定度

合成相對不確定度為

標準溶液配制、標準工作曲線制備、樣品溶液配制、樣品測定重復(fù)性和樣品加標回收率的不確定度貢獻率分別為16.12%、49.15%、7.49%、13.56%和13.68%。

2.4 擴展不確定度

樣品中雷公藤甲素的含量為1.01 μg·kg-1，在95%置信區(qū)間，包含因子k=2，則擴展不確定度為2×0.050 3×1.01=0.10 μg·kg-1。

雷公藤甲素含量為X=（1.01±0.10） μg·kg-1，k=2。

3 結(jié)論

對自制陽性樣蜂蜜中的雷公藤甲素根據(jù)《蜂蜜中雷公藤甲素的測定》（BJS 202108）進行檢測，其結(jié)果平均值為1.01 μg·kg-1，擴展不確定度為0.10 μg·kg-1，結(jié)果表示為X=（1.01±0.10） μg·kg-1，k=2。在雷公藤甲素檢測過程中，對標準溶液配制、標準工作曲線、樣品溶液配制、樣品測定重復(fù)性、樣品加標回收率5 個方面的相對標準不確定度進行分析，標準工作曲線制備的不確定度最大，貢獻率達49.15%，其中包括標準曲線的配制及標準工作曲線的擬合，為控制實驗結(jié)果的準確性，應(yīng)選取檢定合格的玻璃量器及移液器，使用合適的標準曲線濃度點，使陽性樣品濃度在合適的范圍內(nèi)進行測定，在適宜的溫度環(huán)境下，嚴格按照標準進行規(guī)范操作，從而降低標準曲線引入的不確定度。