高遷移率蛋白1/Toll樣受體4信號通路與下肢動脈硬化閉塞癥介入治療后復發的相關性分析

李光澤 張濟 林昌儉 王垚柯 俞慎林

下肢動脈硬化閉塞癥(arteriosclerosis obliterans,ASO)是因形成下肢動脈粥樣斑塊,阻塞血管,導致下肢供血不足,最終全身動脈硬化病變[1]。介入治療可有效再通狹窄或閉塞血管,但介入術后血管再狹窄一直是臨床難以解決的難題。血管再狹窄的具體發生機制可能與炎癥反應、血管內皮損傷、血栓形成等多種原因相關,且血管炎癥反應是ASO介入術后血管再狹窄的重要原因之一[2]。李立濤等[3]研究發現,ASO介入術后再狹窄病人血清內皮素-1(endothelin-1,ET-1)水平升高,并可能與術后狹窄形成相關。李全成等[4]研究發現,術前高敏C反應蛋白(high-sensitive C-reactive protein,hs-CRP)水平升高也是ASO介入術后再狹窄的危險因素。ASO的病理基礎是動脈粥樣硬化(atherosclerosis,AS),而高遷移率蛋白1(high-mobility group box 1,HMGB1)及Toll樣受體(Toll-like receptors,TLRs)途徑可能通過免疫炎癥反應參與AS的發生發展[5]。本文研究HMGB1/TLR4信號通路是否也參與ASO介入術后血管再狹窄,并分析該通路與血管炎癥相關因子ET-1及hs-CRP之間的關系。

對象與方法

一、對象

我院2020年1月～2021年1月間收治的84例,共96條病變血管行介入治療的ASO病人納為研究對象。納入標準:所有病人均符合下肢動脈硬化閉塞癥治療指南(中華醫學會外科學分會血管外科學組,2008年版)中相關診斷標準[6];年齡≥60歲;經下肢血管造影(DSA)或CT血管成像(CTA)證實下肢動脈狹窄程度≥50%;均為首次行介入術治療;術后可配合完成隨訪。排除標準:合并大動脈炎活動期;合并重要器官功能嚴重障礙;精神異常;嚴重凝血功能障礙;因栓子脫落的急性下肢動脈缺血。84例ASO病人中,男50例,女34例,年齡60～77歲,平均年齡(64.54±10.63)歲。36例病人接受球囊擴張術,30例病人接受支架形成術,18例病人接受球囊擴張+支架形成術。本研究經醫院倫理委員會批準,參與者均知情且同意。

二、方法

1.手術方法:根據術前CTA影像學資料評估血管情況,選擇合適的入路,以Seldinger技術穿刺動脈置入鞘管后靜脈給予0.5～1.0 mg/kg肝素進行全身肝素化,放入超滑導絲并跟進導管,從腹主動脈開始行雙側髂動脈及患側肢體動脈造影,根據血管病變情況決定手術方式。造影后將導絲導管通過狹窄或閉塞部位,交換超硬導絲,造影后根據病變情況選擇不同直徑球囊擴張狹窄或閉塞部位,對髂動脈病變多者考慮置放支架,股動脈病變者根據球囊擴張后有無遺留狹窄及夾層等情況選擇性置放支架。

2.外周血單個核細胞(PBMCs)的HMGB1/TLR4 mRNA水平檢測:(1)PBMCs分離:分別于術前及術后1個月,采集所有病人空腹肘靜脈血1 ml,抗凝試管收集,使用外周血單個核細胞分離試劑盒(北京索萊寶)分離單個核細胞。具體操作如下:1 ml外周血與1 ml生理鹽水混合均勻后,每分鐘4 000 r離心20分鐘,溶液從上到下分為分為血漿層、乳白色PBMCs層、透明分離液層及紅細胞層,收集PBMCs至5 ml生理鹽水中,每分鐘4 000 r離心20分鐘,取沉淀洗滌2次,得到PBMCs。(2)逆轉錄實時熒光定量PCR(qRT-PCR):使用Trizol試劑提取PBMCs細胞總RNA,用cDNAiScriptTM合成試劑盒進行RNA反轉錄成cDNA。采用Takara SYBR Premix Ex TaqTM對cDNA進行RT-PCR反應,實驗設定的反應溫度與時間如下:95 ℃預變性30 s,95 ℃變性5 s,60 ℃退火,延伸40 s,40個循環,RT-PCR引物序列如下,HMGB1上游引物:5'-TGCAGATGACAAGCAGCCTT-3';HMGB1下游引物:5'-GCTGCATCAGGCTTTC CTTT-3';TLR4 上游引物:5'-TCCGACGGCCGTCTGCTCGC-3';TLR4 下游引物:5'-TACGGATAGTAGCTGGCCAGCC-3';GAPDH上游引物:5'-TGCCAAATATGATGAC ATCAAGAA-3';GAPDH下游引物:5'-GGAGTGGGTGTCGCTGTTG-3'。利用2-△△Ct方法分析結果,以GAPDH作為內參,將每組所測得的目的基因cDNA拷貝數與其相應的內參相比,得出目標基因的相對含量,上述實驗重復3次。

3.觀察及隨訪:低分子肝素抗凝3～5天,氯吡格雷口服半年,阿司匹林終生服用。術后行CTA檢查,病變血管殘余狹窄<30%,無動脈夾層存在即為成功。術后隨訪12個月,行雙下肢彩超了解靶血管通暢情況,對臨床癥狀嚴重者行雙下肢CTA檢查,血管狹窄≥50%定義為血管再狹窄或復發。

三、統計學方法

結果

1.ASO介入治療術后復發情況:介入治療后,84例病人96條病變血管均開通,隨訪12個月(無病例丟失),經雙下肢超聲及CTA檢查提示有16例病人(共18條病變血管)再狹窄,其中髂動脈病變病人7條,股腘動脈病變病人11條。將16例復發者納為復發組,剩余68例病人納為對照組。

2.兩組病人一般資料比較:兩組性別、年齡、基礎性疾病及住院時間等一般資料進行比較,差異無統計學意義(P>0.05),見表1。

表1 兩組病人一般資料比較

3. 兩組病人HMGB1/TLR4表達水平:復發組病人PBMCs內HMGB1及TLR4表達水平高于對照組,差異有統計學意義(P<0.05),見圖1。復發組HMGB1的相對表達水平為1.26±0.19,對照組HMGB1的相對表達水平為0.52±0.03,兩組比較,差異有統計學意義(P<0.01);復發組TLR4的相對表達水平為2.57±0.22,對照組TLR4的相對表達水平為0.29±0.02,兩者比較差異有統計學意義(P<0.01)。

A.HGMB1 mRNA;B.TLR4 mRNA (**表示P<0.01)

4.兩組ET-1及hs-CRP水平比較見圖2。復發組病人血清ET-1及hs-CRP水平高于對照組,差異有統計學意義(P<0.05)。復發組血清ET-1水平為(76.95±13.68)pg/ml,對照組為(63.15±12.07)pg/ml,兩組比較差異有統計學意義(P<0.01);復發組血清hs-CRP水平為(6.79±1.92)mg/L,對照組為(3.94±1.54)mg/L,兩組比較,差異有統計學意義(P<0.01)。

A.ET-1;B.hsCRP(**表示P<0.01)

5. HMGB1/TLR4水平與ET-1、hs-CRP關系分析見表2。相關性分析提示,復發組病人外周血PBMCs的HMGB1及TLR4水平與血清的ET-1及hs-CRP水平均呈正相關(P<0.05)。

表2 復發組病人PBMCs的HMGB1/TLR4與ET-1、hs-CRP的關系分析

討論

目前,以球囊擴張及支架置入為主要代表的介入治療已成為目前ASO治療的主流。有研究顯示,介入術后3年,下肢動脈狹窄及閉塞動脈病人血管再狹窄率分別為39%和52%,嚴重狹窄及閉塞病人3年復發率更高[7]。體內置入支架后,會導致局部血小板聚集,引起炎癥反應和血栓形成;同時,損傷的血管周圍有大量白細胞聚集,會導致炎癥反應,使平滑肌細胞遷移和增殖,引起內膜增生,發生再狹窄[8]。本研究對84例行介入治療的ASO病人進行為期1年的隨訪,經CTA檢查證實術后1年內有16例病人出現再狹窄,再狹窄發生率為19.05%。

介入術后再狹窄所涉及的原因及機制復雜,其中血管內皮損傷及炎癥反應是最主要的機制之一。血管內皮細胞產生和釋放收縮(內皮素,ET-1)和舒張因子(一氧化氮,NO),以上因子在生理狀態下保持動態平衡,從而維持正常的血管張力和血流量。ET-1是一種活性多肽,由內皮細胞合成及分泌,可刺激平滑肌收縮,也是重要的血管損傷因子[9]。有研究表示,內外界作用對血管的牽拉及刺激,均可促進內皮細胞分泌更多的ET-1,導致血管收縮及狹窄[10]。置入支架可損傷血管內皮細胞,導致ET-1水平升高可預測血管再狹窄的發生[11]。hs-CRP是炎癥反應的敏感標志物,hs-CRP水平升高提示機體炎癥反應,hs-CRP也參與ASO的發生及發展[12]。李全成等[4]研究表明,hs-CRP水平升高是ASO病人介入術治療后復發的危險因素。本研究發現,ASO復發者血清hs-CRP水平高于未復發者,提示hs-CRP也可能參與介入術后血管再狹窄。

HMGB1是HMGB家族中的一員,在多種器官及細胞中表達,可與DNA結合,參與DNA修復、基因轉錄、細胞復制等生命活動。TLR4屬于TLRs家族,TLR4能識別內外源性配體,參與多種病理過程。有研究表示,HMGB1與TLR4結合后,可活化髓樣分化蛋88(MyD88)及Toll/IL-1受體結構域銜接蛋白,活化NF-κΒ,激活炎癥反應,參與AS的發生發展[13]。據報道,hs-CRP可以激活和促進HMGB1的釋放,且在急性冠脈綜合征病人血清HMGB1與hs-CRP存在正相關性,均是反映炎癥程度重要指標[14]。冠心病病人血清HMGB1與ET-1水平成顯著正相關,且可反映病人體內炎癥水平[15]。本研究發現,與對照組未復發病人相比,介入術后復發ASO病人外周血PBMCs內HMGB1及TLR4表達量更高,提示HMGB1/TLR4信號通路可能參與介入術后復發。相關性分析發現,介入術后復發病人外周血PBMCs的HMGB1及TLR4表達量與血管損傷因子ET-1及炎癥因子hs-CRP水平間均呈正相關。提示HMGB1/TLR4信號通路可能通過激活炎癥因子釋放,促進血管損傷,進而參與ASO病人介入術后復發。

本研究存在以下局限性:首先,本研究對HMGB1/TLR4信號通路的檢測受條件限制僅基于外周血PBMCs,缺乏病變部位的直接標本;其次,所獲的結果僅為相關性,并不能明確其機制及因果聯系;最后,本研究未能收集病人手術前的標本,HMGB1/TLR4以及ET-1、hsCRP水平的變化還存在較多混雜因素。

綜上所述,HMGB1/TLR4信號通路可能通過激活炎癥因子釋放,促進血管損傷,進而參與ASO病人介入術后復發。