miR-3619-5p、LINC00857在原發性肝細胞癌血清中表達水平及其臨床診斷價值分析

慕喜喜 李靜 張玄 高小鵬 劉保榮 鐘岳

原發性肝細胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是一種侵襲性強、進展速度快的腫瘤,其病死率居高不下[1]。目前,臨床可根據病理學、影像學結果診斷HCC,但因其操作有創、檢查費用高昂,臨床應用有所限制[2];另外,甲胎蛋白(alpha-fetoprotein,AFP)是臨床診斷HCC的首選血清指標,但部分HCC病人血清AFP呈低濃度或陰性,其診斷HCC的價值不甚理想[2-3]。因此,尋找可有效診斷HCC的方法甚是重要。微小RNA(microRNA,miRNA)與長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA,LncRNA)是兩類非編碼RNA分子,兩者均可輔助診斷HCC[4-5]。既往報道顯示,miR-3619-5p在HCC中呈低表達,其可影響HCC發展進程[6];另外,LncRNA LINC00857在HCC中過表達,其可能是治療HCC的潛在靶標[7]。基于上述研究,本文通過測定miR-3619-5p、LncRNA LINC00857在HCC中的表達水平,旨在分析其與HCC臨床病理特征的關系及其臨床診斷價值。

對象與方法

一、對象

選取2018年1月～2022年3月本院收治的78例HCC病人為HCC組,男性48例,女性30例;年齡41～73歲,平均年齡(58.24±9.85)歲。并納入本院同期救治的76例肝臟良性病變病人為良性病變組,男性43例,女性33例;年齡41～73歲,平均年齡(57.94±9.71)歲;肝膿腫12例,肝囊腫23例,肝血管瘤41例。另選取本院同期診治的78例慢性肝病病人為慢性肝病組,男性44例,女性34例;年齡41～73歲,平均年齡(59.12±9.93)歲;丙肝7例,乙肝38例,肝炎后肝硬化19例,酒精性肝硬化14例。并選取同期78例體檢健康者為對照組,男性46例,女性32例;年齡41～73歲,平均年齡(59.68±9.97)歲。HCC組、對照組、良性病變組、慢性肝病組男女比、年齡相比,差異無統計學意義(P>0.05)。本研究符合《赫爾辛基宣言》中相關要求。HCC納入標準:(1)符合《原發性肝癌診療規范(2017年版)》中HCC診斷標準[8],術前未接受過免疫治療、放化療;(2)基本資料齊全;(3)經病理學、影像學首次確診為HCC。排除標準:合并胃癌、膽管癌等其他惡性腫瘤;合并肺、腎功能嚴重異常;合并系統性免疫缺陷病。

二、方法

1.樣本收集:收集HCC組、對照組、良性病變組、慢性肝病組受試者空腹外周血4～6 ml,自然凝集30分鐘,5 200 r/min離心5分鐘,分離血清,存于-70 ℃冰箱。

2.實時熒光定量PCR(quantitative real-time PCR,qRT-PCR)法檢測血清miR-3619-5p、LncRNA LINC00857表達水平:解凍血清樣本,加TRIzol LS Reagent(10296010,Invitrogen公司)獲取血清總RNA,隨后,利用RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit(K1621,Fermentas公司)獲得cDNA;最后,使用SYBR Green Realtime PCR Master Mix(QPK-201,TOYOBO公司)、qRT-PCR儀(LightCycler96,羅氏公司)擴增cDNA。U6、GAPDH分別是miR-3619-5p、LncRNA LINC00857的內參基因,其引物序列見表1。miR-3619-5p、LncRNA LINC00857表達水平以2-△△CT法計算。

表1 miR-3619-5p、LncRNA LINC00857及內參U6、GAPDH的引物序列

3．電化學發光法檢測血清AFP水平:解凍適量血清,使用全自動電化學發光分析儀(Cobas e602,Roche)按電化學發光法檢測血清AFP水平,具體操作按儀器說明書進行。

三、統計學方法

結果

1.各組血清miR-3619-5p、LncRNA LINC00857、AFP水平比較:對照組、慢性肝病組、良性病變組、HCC組病人血清miR-3619-5p、LncRNA LINC00857、AFP水平比較,差異有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 各組血清miR-3619-5p、LncRNA LINC00857、AFP水平比較

2.血清miR-3619-5p、LncRNA LINC00857表達水平與HCC臨床病理特征關系:HCC病人血清miR-3619-5p、LncRNA LINC00857表達水平與HCC分化程度、門靜脈癌栓、TNM分期有關(P<0.05),與性別、年齡、腫瘤大小、病灶數、HBV抗原情況、肝硬化無關(P>0.05)。見表3。

表3 血清miR-3619-5p、LncRNA LINC00857表達水平與HCC臨床病理特征關系

3.HCC病人血清miR-3619-5p水平與LncRNA LINC00857相關性:Pearson法分析顯示,HCC病人血清miR-3619-5p水平與LncRNA LINC00857呈負相關(r=-0.586,P<0.05)。見圖1。

圖1 HCC病人血清miR-3619-5p水平與LncRNA LINC00857的相關性

4.血清miR-3619-5p、LncRNA LINC00857、AFP對HCC的診斷價值:ROC曲線分析顯示,血清miR-3619-5p、LncRNA LINC00857診斷HCC的曲線下面積(area under curve,AUC)分別為0.870、0.868,高于AFP診斷HCC的AUC(0.701),miR-3619-5p、LncRNA LINC00857聯合診斷HCC的AUC為0.956,高于二者單獨診斷,且miR-3619-5p、LncRNA LINC00857聯合診斷的靈敏度為94.9%,特異度為86.4%,有較高診斷價值。見表4。

表4 各項指標對HCC的診斷效能

討論

miRNA可調控癌細胞增殖,參與上皮-間質轉化,調節血管新生,與膀胱尿路上皮癌、HCC等病理發展有關[4,6,9]。研究發現,miR-3619-5p在結直腸癌中表達下調,其可能是結直腸癌的治療靶點[10];另外,miR-3619-5p在胃腺癌中呈低表達,其在胃腺癌中發揮抑癌作用[11]。本研究顯示,HCC病人血清miR-3619-5p表達水平較低,與Hu等[6]研究趨勢類似,提示miR-3619-5p可能與HCC病變進程相關,推測miR-3619-5p可能通過與有關靶基因相結合,進而影響血管生成[10-11],從而影響HCC病理發展。進一步分析發現,HCC病人血清miR-3619-5p表達水平與分化程度、門靜脈癌栓、TNM分期顯著有關,提示miR-3619-5p表達水平可能與HCC嚴重程度密切相關,miR-3619-5p可作為評估HCC進展程度的輔助指標。此外,經ROC曲線分析發現,血清miR-3619-5p診斷HCC的AUC為0.870,提示miR-3619-5p對HCC有一定診斷價值,當血清miR-3619-5p表達水平<0.68時,HCC發生幾率較高,臨床應及時關注此類HCC病人,及時干預,改善HCC病人預后。

LncRNA可影響上皮-間質轉化過程,參與癌細胞增殖、凋亡等過程,與HCC等發生發展相關[5,7]。既往研究顯示,LncRNA LINC00857在胰腺癌中呈過表達,其可能是治療胰腺癌的潛在靶點[12];另外,LncRNA LINC00857在結直腸癌中表達上調,其可能影響結直腸癌發展過程[13]。本研究中,HCC病人血清LncRNA LINC00857表達水平較高,與Xia等[7]研究結果相似,提示LncRNA LINC00857表達水平升高可能與HCC發生發展關系密切。本研究顯示,Ⅲ期、有門靜脈癌栓、低分化的HCC病人血清LncRNA LINC00857表達水平更高,表明LncRNA LINC00857可能與HCC嚴重程度有關,LncRNA LINC00857有望成為臨床判定HCC病人疾病程度的血清指標。此外,我們發現,血清LncRNA LINC00857診斷HCC的AUC為0.868,表明LncRNA LINC00857具有診斷HCC的潛在價值,其或可為診斷HCC的輔助指標。

AFP是臨床診斷HCC的最常用指標,但其靈敏度較低,易造成HCC漏診[2-3,14]。我們研究發現,HCC組病人血清AFP水平較高,且AFP診斷HCC的AUC為0.701,低于miR-3619-5p、LncRNA LINC00857對HCC的診斷價值;故將miR-3619-5p、LncRNA LINC00857進行聯合用于診斷HCC,結果顯示,二者聯合診斷HCC的AUC為0.956,提示miR-3619-5p、LncRNA LINC00857聯合對HCC有較高的診斷價值,有益于臨床診斷HCC。另外,本文中HCC病人血清miR-3619-5p水平與LncRNA LINC00857呈負相關,提示miR-3619-5p可能與LncRNA LINC00857共同影響HCC病理變化。

綜上,HCC病人血清miR-3619-5p表達下調,LncRNA LINC00857表達上調,miR-3619-5p、LncRNA LINC00857均具有診斷HCC的潛在價值,且二者聯合對HCC有較高的診斷價值,為臨床診斷HCC提供新參考。但研究樣本較少,且未深入分析miR-3619-5p與LncRNA LINC00857的關系,后期將擴大樣本,并結合基礎研究進行深入探討。