食用菌促生細菌研究進展

于 瀟,李冠喜

(曲阜師范大學生命科學學院,曲阜 273165)

食用菌通常指子實體碩大、可供食用的大型真菌,一般通稱為蘑菇[ 1]。 目前大約有14 000 種食用菌被成功鑒定,其中10%為大型真菌[ 2]。 約有700 種食用菌可安全食用,且對人體健康有益[ 3]。

食用菌促生細菌(Mushroom growth-promoting bacteria,MGPB)[ 4]是指通過分泌或者分解某種物質對食用菌生長產生促進作用的有益細菌。 最早發現并應用的促生細菌為植物根際促生菌(Plant growthpromoting rhizobacteria,PGPR),是生存于植物根際、根表,對植物生長有促進或對病原菌有拮抗作用的有益細菌[ 5]。 Frey-Klett 等[ 6]研究發現,在許多環境中,細菌和真菌是共存并相互作用的。 細菌在食用菌的不同發育階段均起著重要的作用。 Kong 等[ 7]利用宏基因組測序技術研究了平菇栽培中玉米芯堆肥微生物群落的動態變化及其代謝功能,發現不同堆肥階段優勢菌門不同。 食用菌促生細菌(MGPB)可以通過分泌生長激素、分解代謝營養菌絲產生的抑制性揮發物、增溶磷酸鹽、產鐵載體和1-氨基環丙烷-1-羧酸脫氨酶(Acc deaminase)促進食用菌的生長[ 8]。 雖然MGPB 對于食用菌的生產十分有利,但是和PGPR 相比,目前用于食用菌栽培的MGPB 的種類和數量還十分有限[ 4]。 本文就MGPB 對食用菌的促生作用及機理進行綜述,同時對其應用前景進行討論和展望,以期為MGPB 更深入的研究提供理論指導。

1 食用菌促生細菌獲得方法

1.1 細菌的分離

目前,促生細菌主要從食用菌子實體內部或食用菌生存環境中分離。 從食用菌子實體內部分離促生細菌需先對子實體表面進行消毒,目前使用的消毒方法較多,如Xiang 等[ 9]利用70%乙醇消毒60 s,然后用1.0%次氯酸鈉消毒5 min,70%乙醇消毒30 s,用無菌蒸餾水徹底清洗;Ding 等[ 10]則是先用自來水洗凈,再用70%乙醇浸泡1 min,然后用1%次氯酸鈉處理10 min,再將子實體用無菌水多次洗滌;還可用0.1%的氯化汞溶液也可代替次氯酸鈉溶液進行消毒[ 11]。 之后,取最后一次的洗滌水涂在營養瓊脂平板,適宜溫度下培養3 d 進行無菌檢查,采用研磨法、印跡法或組織分離法分離細菌[ 12]。

從食用菌具體生存環境中分離促生細胞需要制作菌懸液,不同研究選用的制作方法不同。 Xing等[ 13]將1 g 樣品懸浮在9 mL 無菌水中,搖瓶培養15 min。 Young 等[ 4]將采集到的土壤與無菌水以1∶1(w∕w)比例浸泡,并在25 ℃下搖瓶培養30 min。 Kumari 等[ 8]則將1 g 土壤混合到2 mL 無菌水中,并適當搖動。 樣品和無菌水的比例以及搖瓶培養時間和溫度可以根據實際情況進行調整,如杏鮑菇的適宜溫度為23—25 ℃[ 14],平菇為15—25 ℃[ 15]。 搖瓶培養后涂板培養,平板培養基可以是溶菌肉湯培養基(Lysogeny broth,LB)、大豆酪蛋白瓊脂培養基(Tryptose soya agar,TSA)、R2A 瓊脂培養基(R2A agar,R2A)[ 16]或營養瓊脂(Nutrient agar,NA)[ 4]等。 之后選取形態不同的單菌落進行純化并保存。

1.2 促生細菌作用的測定

可通過平板試驗,檢測分離出的細菌是否為促生細菌。 王琳等[ 17]將平板分為十字對稱的4 個區域,真菌菌絲塊置于十字中心,取一定濃度的菌液點涂在十字四條線的中點位置,觀察菌絲在點菌位置與平板上無細菌區域的生長差異。 Lim 等[ 18]將刺芹側耳(Pleurotus eryngii)菌絲塊放在PDA 平板中央后,用菌液在菌絲塊兩側劃兩條平行直線,以觀察細菌與真菌共生情況。 Kim 等[ 19]和Rainey[ 20]將培養一定天數的菌液加入到馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養基中,均勻涂布,并將真菌菌絲塊置于培養基中央進行共培養,觀察菌絲是覆蓋細菌菌落還是避開菌落生長。 Suarez 等[ 16]研究發現,共同培養7 d 內,盧平小單胞菌(Micromonospora lupini)對糙皮側耳(Pleurotus ostreatus)無促生作用,但21 d 后,糙皮側耳菌絲繼續徑向生長,說明細菌和真菌之間是需要一定時間來適應的,且通常是通過雙方代謝產物以互利互惠而不是消耗彼此菌體。 Vos 等[ 21]研究發現,雙孢蘑菇(Agaricus bisporus)可以通過降解纖維素為堆肥中的細菌提供單糖,而細菌可以為雙孢蘑菇提供維生素等物質。 Rangel-Castro 等[ 22]發現,與雞油菌共生的假單胞菌屬細菌是受益于真菌產生的糖和氨基酸等營養物質,而不是通過水解真菌細胞壁來獲得營養。 另外,熒光假單胞菌(Pseudomonas fluorescent)可以為雙孢蘑菇提供生長激素促進其生長[ 9]。

判斷1 株細菌是否是MGPB,還可通過細菌-菌絲液體共培養的方式進行,主要通過比較菌絲重量變化來判斷細菌的促生效果[ 23]。 值得注意的是,細菌對食用菌的促生作用不一定表現在促進菌絲的生長上。 Young 等[ 4]研究發現,在平皿共培養中對巴氏蘑菇(Agaricus blazei)菌絲生長無積極作用的細菌,對其出菇反而有促進作用。 而Min 等[ 19]也發現有一種假單胞菌的上清液除了能讓刺芹側耳菌絲生長速率提高1.6 倍外,還能誘導原基形成。

通過對食用菌促生細菌16S rDNA 進行測序,并結合細菌形態學等指標來確定細菌的屬或種。 部分已經驗證的MGPB 及其所作用的食用菌種類見表1。

表1 部分MGPB 及其所作用的食用菌Table1 Part of MGPB and relevant mushroom

2 食用菌促生細菌的作用機制

2.1 細菌頂空化合物

細菌產生并釋放的揮發性次生代謝物稱為細菌頂空化合物[ 16]或細菌揮發性化合物[ 30](BVC)。 BVC多種多樣,如脂肪酸衍生物(碳氫化合物、酮、醇)、酸、含硫、含氮化合物和萜烯等有機物,及一氧化氮、硫化氫、氨、氰化氫等無機物。 Suarez 等[ 16]首次采用雙平板共培養法分析了BVC 對糙皮側耳菌絲生長的影響,該方法是利用二分格平皿將細菌與真菌分隔開,一格培養細菌(用細菌培養基),一格放入糙皮側耳菌絲塊(用真菌培養基)。 糙皮側耳菌絲和細菌二者之間不接觸,細菌產生的BVC 可以通過平皿上方的間隙揮發到糙皮側耳菌絲處并對其產生影響。

頂空固相微萃取-氣質聯用技術[ 31](HS-SPME-GC-MS)可以對BVC 各成分進行測定與分析。 楊柳等[ 32]利用該技術,對鷹嘴豆納豆發酵過程中揮發性成分進行了檢測。 Gong 等[ 33]發現黏質沙雷氏菌(Serratia marcescens)產生的揮發物能夠通過抑制植物病原真菌的生長來促進玉米的生長,利用頂空固相微萃取-氣質聯用技術分析其揮發物成分,發現其中起作用的是二甲基二硫醚(C2H6S2)。

2.2 可溶性化合物

為驗證細菌產生的可溶性化合物對食用菌生長的影響,Suarez 等[ 16]將菌絲塊放在PDA 平板中央,用菌液在菌絲塊兩側劃兩條平行的直線,培養7 d 后,發現部分細菌對菌絲生長起正面影響。 Chen 等[ 27]用不同體積的蠟樣芽孢桿菌(Bacillus cereus)發酵液加入到刺芹側耳菌絲培養的平皿中,發現不同體積上清均能促進其菌絲生長。 Lim 等[ 18]發現不同濃度細菌發酵液對刺芹側耳菌絲生長有促進作用。 Kim 等[ 19]發現,在菌絲滿瓶前加入1 株假單胞菌屬(Pseudomonassp.)細菌的上清液可以縮短原基的形成時間。

2.3 酶類物質

細菌對食用菌的促生作用離不開酶的作用,正是因為特定酶的活動,MGPB 才表現出解纖維素(為食用菌生長提供碳源)、分解乙烯(減輕其對菌絲生長的抑制)、合成生長激素(促進食用菌生長)亦或者是消耗1-辛烯-3-醇等(解除其對食用菌原基形成的抑制)特征。

2.4 細菌菌體

研究發現,一些細菌緊密附著在菌絲上以刺激菌絲的生長發育。 Rainey[ 20]發現惡臭假單胞菌可通過與雙孢蘑菇菌絲接觸的方式來減少其分枝頻率以提高徑向增長速率。 Chen 等[ 34]也發現惡臭假單胞菌是附著在雙孢蘑菇菌絲上的。 Kumari 等[ 8]通過電鏡觀察發現被1 株谷氨酸桿菌(Glutamicibacter arilaitensis)附著的佛州側耳(Pleurotus florida)菌絲更厚、更健康。 此外,細菌菌體還可通過分泌生長素和降解有害物質等方式促進食用菌的生長發育。

3 促生長細菌的關鍵特征

3.1 解纖維素

食用菌生產用基質根據其成分可分為三類[ 35]。 第一類是原木;第二類是在培養料中添加木屑,制成人造原木;第三類則是除添加木屑外,還添加秸稈[ 36](包括玉米稈、麥稈、稻草等)、麩皮[ 37]、玉米芯[ 38]、棉籽殼[ 37]等富含纖維素的成分。 Michael 等[ 35]認為香菇等木腐菌菌絲生長速度取決于其本身對木質纖維素的降解能力。 高纖維素酶含量是雙孢蘑菇整個生殖階段的特征[ 39]。 而纖維素降解菌可以提高秸稈降解效果并縮短降解時間[ 40]。 Xiang 等[ 9]發現了1 株產纖維素酶能力較強的解淀粉類芽孢桿菌(Paenibacillus amylolyticus),推測其可能通過降解纖維素為雙孢蘑菇提供碳源。 Kasana 等[ 41]提供了一種快速篩選產纖維素酶細菌的方法,即以纖維素為唯一碳源的培養基培養細菌后,加入革蘭氏碘(Gram’s iodine)溶液代替剛果紅或者十六烷基三甲基溴化銨。 這種方法操作簡單,且安全性和效率更高。

3.2 分解乙烯

在食用菌的栽培過程中會產生乙烯,而乙烯對食用菌子實體的發育有抑制作用。 1975 年,Turner等[ 39]用氣相色譜-質譜聯用儀分析發現,乙烯是由菌絲體-堆肥復合體產生的,而不是由子實體本身產生的[ 39]。 Wood 等[ 42]和Ohga[ 43]也分別在雙孢蘑菇和香菇的研究中發現,乙烯是在菌絲生長和子實體發育階段從基質中產生的。 Turner 等[ 39]研究認為,在整個食用菌的生長發育過程中,從菌絲的生長到子實體的成熟,乙烯不斷增多。 周巍巍等[ 44]發現雙孢蘑菇可以在生長發育過程中產生乙烯,且其乙烯合成途徑可能與高等植物相同。 Chen 等[ 34]研究也證明雙孢蘑菇有與高等植物相似的乙烯合成途徑。 董曉雅等[ 29]研究發現,熒光假單胞菌懸液、乙烯受體抑制劑AgNO3、乙烯合成抑制劑CoCl2可顯著提高食用菌菌絲的生長速度。 Chen 等[ 34]發現了1 株產ACC 脫氨酶的惡臭假單胞菌,它可以分解ACC 以降低乙烯的濃度,從而促進雙孢蘑菇菌絲的生長,誘導原基的形成。

3.3 其他特征

生長激素(IAA)促進食用菌的生長,許多細菌能通過編碼tnaA生成的色氨酸酶將色氨酸轉化成吲哚[ 30,45]。 有些促生細菌可以通過解磷作用促進食用菌生長[ 46]。 還有些細菌通過消耗1-辛烯-3-醇(1-octen-3-ol)來促進食用菌生長。 而有些細菌能夠利用并代謝影響食用菌子實體發育的物質[ 47]。Zarenejad 等[ 48]發現從覆土中分離的細菌中有97%的菌株能夠在高濃度的1-辛烯-3-醇揮發性化合物存在下生長,接種具有這一特性的菌種可使雙孢蘑菇的產量提高14%,這在工業化生產中具有重要意義。

MGPB 也可以通過產生鐵載體[ 48]、固氮[ 49]或者是抑制霉菌的生長[ 50]來促進食用菌的發育和生長。以上提到的促生特征中有很多也是PGPR 的特征[ 51],其可以為MGPB 的開發提供思路和切入點。

4 總結和展望

雖然食用菌工廠化發展迅猛,但暴露的問題越來越多,如病蟲害日趨加重、農殘超標、產業效益下滑等。 蘑菇生長促進劑(Mushroom growth promoting,MGP)有兩種形式,即活體制劑和代謝產物制劑[ 5],可用于提高作物產量[ 52]。 活菌制劑因含有活菌體,利于改良作物生活環境及其本身的微生態環境,具有良好的生態學意義。 目前,以生物制劑代替化學制劑促進食用菌生長是食用菌種植業面臨的一個新的、迫切需要解決的問題[ 8]。

MGPB 具備產纖維素酶、溶解磷酸鹽、產IAA 及ACC 脫氨酶等特征。 MGPB 還可以消耗雙孢蘑菇菌絲產生的但抑制子實體發育的1-辛烯-3-醇。 不同MGPB 具有不同的促生特征,未來或許可以將已有的MGPB 菌株改造為無毒無害的高效工程菌株或尋找到促生效果更優秀的菌株,用于制備更優質的生物制劑,以改善食用菌品質,促進食用菌行業健康發展。