防治甜瓜細菌性果斑病種傳病原菌的殺菌劑篩選

林 濤,馬國斌,姜守陽,張克巖,李菊芬*

(1 上海市農業科學院設施園藝研究所,上海市設施園藝技術重點實驗室,上海 201106;2 上海農科種子種苗有限公司,上海 201106)

細菌性果斑病(Bacterial fruit blotch,簡稱BFB)是由燕麥嗜酸菌西瓜亞種(Acidovorax avenaesubsp.citrulli)引起的一種多發于葫蘆科作物的世界性病害[ 1],也是我國植物檢疫性病害之一。 在高溫高濕環境下,病原菌可快速繁殖,導致作物在苗期爛苗毀苗[ 2],果實膨大期主要侵染葉片和果實,使其失去商品價值,造成減產,嚴重危害我國西瓜、甜瓜及其他葫蘆科作物的生產[ 3]。 由于細菌性果斑病是典型的種傳病害,且其病原菌具有存活時間長、抗逆、抗干旱、抗衰老、致病力強等特點[ 4-6],因此對帶菌種子進行滅菌處理,控制和消除病害的最初侵染來源是防治該病害的關鍵。

目前,種子發酵[ 7]、高溫干燥處理[ 8-9]、藥劑處理[ 10-12]等方法均可不同程度地殺滅種子所攜帶的細菌性果斑病菌。 由于藥劑處理方便快捷、效果顯著,因此種子處理的方法多以藥劑處理為主。 目前,關于甜瓜帶菌種子的藥劑處理雖已有報道,但存在藥劑更新慢、研究結果不一致等問題[ 13-14]。 本研究選用16 種殺菌劑進行帶菌種子處理試驗,以期建立一套更安全、更高效的甜瓜帶菌種子的處理方法,為甜瓜細菌性果斑病的防治提供技術參考。

1 材料與方法

1.1 材料

供試甜瓜種子:在新疆繁育的攜帶瓜類細菌性果斑病菌的甜瓜種子。

供試菌株:由中國農業科學院鄭州果樹研究所提供的細菌性果斑病標準菌株(Acidovoras avenae

subsp.citrulli)。

供試殺菌劑:共16 種,參考推薦使用劑量,每種殺菌劑選擇3 個稀釋倍數,使用無菌水稀釋,現配現用(表1)。

表1 供試殺菌劑Table 1 The tested bactericides

1.2 方法

1.2.1 混菌平板的制作

將培養48 h 的供試菌株配制成108CFU∕mL 的菌懸液,按體積比1∶20 的比例將菌懸液和40 ℃的LB培養基(瓊脂粉用量為15 g∕L)混合均勻,倒板(平板直徑9 cm)后于超凈臺內吹干備用[ 15]。

1.2.2 殺菌劑抑菌效果的測定

采用抑菌環法。 將直徑為6 mm 的滅菌濾紙片置于含菌平板上,每皿3 片,等邊三角形放置。 分別取配制好的殺菌劑5 μL 滴于濾紙片上,于超凈臺內吹干,28 ℃下倒置培養48 h 后,用十字交叉法測量抑菌環直徑[ 15],以無菌水處理為對照,每個處理重復3 皿。 菌落生長抑菌率=[(處理抑菌環直徑-對照抑菌環直徑)∕處理抑菌環直徑 ] ×100%[ 16]。

1.2.3 種子的殺菌劑處理和PCR 檢測

稱取完整帶菌種子10 g,放入滅菌三角瓶中,加入50 mL 配制好的殺菌劑,分別處理30 min、60 min和90 min 后用流水沖洗3 次,再加入10 mL 無菌水,于28 ℃、220 r∕min 搖培4 h,取1 μL 搖培提取液作為PCR 模板,進行PCR 檢測。 以帶菌種子加入10 mL 無菌水進行搖培作為對照(CK),各處理設置3 個重復。

選用特異引物BX-L1:5’-CAGCTGGGAGCGATCTTCAT-3’ 和BX-S-R2:5’-GCGTCAGGAGGGTGAGTAGCA-3’進行PCR 擴增[ 17]。 引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。 PCR 所需試劑均購于天根生化科技(北京)有限公司。 PCR 反應體系(25 μL):10 × buffer 2.5 μL,MgCl22 mmol∕L,dNTPs 0.2 mmol∕L,Taq DNA 聚合酶1 U,正反向引物各0.2 μmol∕L,模板1 μL,無菌三蒸水補齊。 擴增條件:95 ℃3 min;94 ℃35 s,60 ℃35 s,72 ℃45 s,35 個循環;72 ℃7 min。 PCR 儀為BIO-Rad T100TM Thermal Cycler。 擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳和Goldview 染液染色后,于紫外凝膠成像系統(Tanon 3500)下觀察并拍照[ 18]。

1.2.4 病原菌存活檢測

半選擇性KB 培養基的配制參照李菊芬等[ 9]:蛋白胨20 g∕L,丙三醇10 mL∕L,MgSO4·7H2O 1.5 g∕L,K2HPO41.5 g∕L,瓊脂15 g∕L,pH 調至7.0,121 ℃滅菌20 min,冷卻至50 ℃時加入氨芐青霉素20 mg∕L、新生霉素5 mg∕L、放線菌酮25 mg∕L。

取1.2.3 節中的搖培提取液100 μL,于半選擇性KB 培養基上均勻涂板,超凈臺內吹干,置于28 ℃恒溫培養箱中倒置培養48 h 后觀察結果。 各處理設置3 個重復。 平板上菌落的計數標準為(個∕皿) -:菌落數為0;+:0 ＜菌落數≤10; ++:10 ＜菌落數≤100; +++:100 ＜菌落數≤500; ++++:500 ＜菌落數;+++++:菌落長滿整個平板連成片[ 19]。

總菌落DNA 提取及PCR 檢測:無菌水沖洗半選擇性KB 培養基表面上的所有細菌菌落,離心濃縮,并提取基因組DNA[ 18],以此為模板,進行PCR 驗證。 反應體系及擴增程序同1.2.3 節。

1.2.5 殺菌劑處理對種子發芽的影響

取1.2.3 節殺菌劑處理后的種子各100 粒,無菌水浸泡12 h 后置于培養皿中,無菌水棉球保濕,35 ℃恒溫培養箱中催芽24 h,統計發芽率和根長。

1.2.6 殺菌劑處理對苗期發病的影響

育苗基質采用滅菌的泥炭和蛭石,以體積比3∶1的比例混合,裝入50 孔的育苗穴盤中,用無菌水澆透。 取1.2.3 節殺菌劑處理后的種子,每個處理播1 盤,各處理重復3 次。 培養條件為:8 h 光照,28 ℃;16 h 黑暗,20 ℃;濕度50%—70%。 出苗10 d 后,統計發病率。

2 結果與分析

2.1 不同殺菌劑對甜瓜細菌性果斑病菌的抑菌效果

如圖1 和表2 所示,16 種殺菌劑中僅有5 種能形成不同直徑的抑菌環。 殺菌劑1 號各稀釋倍數均具有明顯的抑菌環,其中以100 倍液的抑菌環直徑最大,抑菌效果最佳,抑菌率可達78.62%;200 倍液和300 倍液的抑菌率分別為68.72%和67.41%。 0.3%四霉素的3 個稀釋倍數也具有不同直徑的抑菌環,其中以250 倍液的抑菌環直徑較大,抑菌效果相對較好,抑菌率為60.94%,與500 倍液和750 倍液之間存在顯著差異。 萎銹·福美雙原液和100 倍液也有抑菌效果,且原液和100 倍液的抑菌環大小存在顯著差異。 2%春雷霉素和4%咯菌·噻霉銅僅原液具有抑菌效果。 綜合考慮藥劑的抑菌效果及實際使用成本,后續試驗分別選用殺菌劑1 號200 倍液、萎銹·福美雙100 倍液和0.3%四霉素250 倍液進行。

圖1 不同殺菌劑對甜瓜細菌性果斑病菌的抑菌環比較Fig.1 Comparison of antibacterial rings of different bactericides against bacterial fruit blotch pathogens in melon

表2 不同殺菌劑對甜瓜細菌性果斑病菌的抑菌效果Table 2 Antibacterial effects of different bactericides on bacterial fruit blotch pathogens in melon

2.2 不同殺菌劑的殺菌效果

2.2.1 PCR 檢測

依據抑菌環結果,用殺菌劑1 號200 倍液、萎銹·福美雙100 倍液和0.3%四霉素250 倍液對帶菌種子分別進行30 min、60 min 和90 min 的殺菌處理,并以處理后的種子搖培液為模板進行PCR 檢測。 如圖2 所示,所有處理均能檢測到特異性目的條帶(279 bp)。

圖2 不同殺菌劑處理帶菌種子的PCR 檢測Fig.2 PCR detection of seed treated with different bactericides

2.2.2 活菌分離和病原菌檢測

為進一步檢驗殺菌劑處理后是否還有存活的細菌性果斑病菌,進行了活菌分離驗證。 結果表明:殺菌劑1 號200 倍液分別處理帶菌種子30 min、60 min 和90 min 后,半選擇性KB 培養基上均無菌落長出,病原菌被有效殺滅。 帶菌種子經萎銹·福美雙100 倍液處理30 min、60 min 和90 min 后,平板上均長滿菌落,與對照相當;經0.3%四霉素250 倍液處理不同時間后,48 h 內長出的菌落數量與對照相比均明顯減少(表3)。 對半選擇性KB 平板上長出的總菌落進行DNA提取及病原菌PCR 檢測,如圖3 所示,均能檢測到細菌性果斑病菌的特異性目的條帶(279 bp),表明帶菌種子經0.3%四霉素250 倍液和萎銹·福美雙100 倍液處理后仍有部分病原菌存活。

圖3 半選擇性KB 培養基上總菌落的PCR 檢測Fig.3 PCR detection of bacterial colonies on semi-selective KB medium

表3 不同殺菌劑處理后的種子懸浮液在半選擇性KB 培養基上的涂板結果Table 3 Culture results of seed suspensions treated with different fungicides on semi-selective KB medium

綜上可知,帶菌種子經殺菌劑1 號200 倍液處理后未能分離出病原活菌,殺菌效果最佳;其次是0.3%四霉素250 倍液,處理后雖仍能檢測到病原活菌,但菌落總數比對照明顯減少;而萎銹·福美雙100倍液處理后既能檢測到病原活菌,且菌落總數與對照無明顯差異。 故選取前2 種殺菌劑進行后續種子發芽及苗期發病試驗。

2.3 殺菌劑處理對種子發芽的影響

依據病原菌存活檢測的結果,選取經殺菌劑1 號200 倍液和0.3%四霉素250 倍液處理后的種子進行發芽試驗,結果表明:所有處理及對照的發芽率均在90%以上。 與對照(95.9%)相比,除殺菌劑1 號200 倍液處理30 min 后發芽率(93.9%)略有降低外,其他處理均高于對照。 帶菌種子經殺菌劑1 號200 倍液分別處理30 min 和60 min 后,平均根長與對照相比無顯著差異;但處理90 min 后,平均根長顯著低于對照。 帶菌種子經過0.3%四霉素250 倍液分別處理30 min、60 min 和90 min 后,平均根長與對照相比均有顯著提高(表4)。

表4 不同殺菌劑處理對種子發芽的影響Table 4 Effects of different bactericides on seed germination

2.4 殺菌劑處理對苗期發病的影響

出苗10 d 后,幼苗開始出現病癥。 如表5 所示,帶菌甜瓜種子經0.3%四霉素250 倍液和殺菌劑1 號200 倍液處理后,苗期的發病率與對照相比均有顯著降低,但該2 種殺菌劑不同處理時間的苗期發病率無顯著差異。

表5 不同殺菌劑處理對幼苗發病率的影響Table 5 Effects of different bactericides on incidence rate of seedlings

3 結論與討論

甜瓜細菌性果斑病的傳播主要依賴于種子帶菌傳播,播種后在設施內的高溫、高濕環境下,病害可迅速蔓延[ 20]。 因此,種子殺菌處理是防治甜瓜細菌性果斑病的有效手段。

本研究通過抑菌環試驗,對16 種殺菌劑進行了篩選,發現其中5 種殺菌劑對細菌性果斑病菌有不同程度的抑菌效果。 結合實際使用成本,選用抑菌效果較好的3 種殺菌劑(殺菌劑1 號200 倍液、萎銹·福美雙100 倍液和0.3%四霉素250 倍液)對帶菌種子進行處理。 經PCR 檢測,處理后的種子均能檢測到特異性目的條帶;進一步活菌分離試驗發現,殺菌劑1 號200 倍液處理帶菌種子后,在半選擇性培養基上無菌落長出,0.3%四霉素250 倍液處理檢測到的菌落總數與對照相比明顯減少,而萎銹·福美雙100 倍液的處理與對照無明顯差異。 殺菌劑1 號的有效成分為異噻唑啉酮和二硫氰甲烷[ 19],在殺菌過程中可使病原菌的蛋白質變性,消滅細胞的活性,也可使病原菌的遺傳基因發生變異或干擾細胞內部酶的活性使其難以繁殖生長,從而起到抑制作用[ 21];0.3%四霉素屬于抗生素類殺菌劑,主要對病原菌的細胞壁、細胞膜、蛋白質合成系統及能量代謝系統等起作用,還可作用于植物,激發抗性防御反應[ 22]。 另外,帶菌種子經殺菌劑處理后雖然PCR 檢測結果仍然為陽性,但病菌可能已被殺死,PCR 檢測到的可能是部分死菌的殘留DNA,這與李菊芬等研究結果一致[ 9]。 因此,PCR 檢測具有一定的局限性,應進一步結合活菌分離試驗,這樣的檢測結果才更可靠。

種子發芽試驗表明,與對照相比,殺菌劑1 號200 倍液和0.3%四霉素250 倍液分別處理30 min、60 min 和90 min 后對種子發芽率無明顯影響;但殺菌劑1 號200 倍液處理90 min 后對平均根長有顯著抑制作用,其有效成分異噻唑啉酮和二硫氰甲烷均具有一定腐蝕性[ 19],隨著處理時間的延長,滲透過種皮,可能對種胚造成一定影響,延緩了根的伸長。 0.3%四霉素250 倍液的主要成分為抗生素,經微生物發酵獲得,內含的有機營養成分可能對胚根生長具有一定促進作用。

苗期發病試驗顯示,經殺菌劑1 號200 倍液和0.3%四霉素250 倍液處理后的帶菌種子,其苗期發病率與對照相比均顯著降低,且同一殺菌劑不同時間處理的苗期發病率之間無顯著差異。 雖然在殺菌劑1號200 倍液處理后的帶菌種子中未檢測到病原活菌,但在苗期依然有一定的發病率,這可能是由于甜瓜細菌性果斑病菌不僅存活于種子表面,種子內部也有寄藏,且具有高抗逆性和存活時間較長的特點,因而對檢測和殺菌造成難度[ 23]。

綜上,采用殺菌劑1 號200 倍液或者0.3%四霉素250 倍液處理帶菌甜瓜種子60 min,可有效殺滅種子所攜帶的細菌性果斑病菌,而且對種子發芽和生長無明顯不良影響,還可顯著降低幼苗的發病率。 種子處理可從源頭對病害進行預防和控制,對甜瓜生產實踐具有重要的應用價值。