長鏈非編碼RNA Linc00511在肺癌血清中的表達及臨床診斷價值

霍艷，郭紅艷，徐亞茹，李耕慧，孫曉杰，趙正林，吳琦，劉波

1.齊齊哈爾醫學院醫學技術學院，黑龍江齊齊哈爾 161000；2.齊齊哈爾醫學院附屬第一醫院檢驗科，黑龍江齊齊哈爾 161006；3.齊齊哈爾市第一醫院老年科，黑龍江齊齊哈爾 161000；4.齊齊哈爾醫學院附屬第二醫院辦公室，黑龍江齊齊哈爾 164000

肺癌（lung cancer）是人類常見的惡性腫瘤之一，發病率和病死率高居世界首位，且其發病率在相當長的時間內將繼續呈上升趨勢。盡管肺癌治療手段在不斷更新，但該病總體預后仍然較差[1]，這與肺癌的發病機制不清，缺乏有效的早期診斷和預防手段有關[2]。研究發現，腫瘤細胞中的某些特定LncRNA表達水平會發生異常改變，LncRNA有可能成為癌癥早期診斷的潛在生物學標志物和藥物治療靶點[3-4]。Linc00511在多種腫瘤中表達失調，與人類惡性腫瘤的預后和轉移相關，本研究通過實時熒光定量PCR方法檢測2017年9月—2018年2月期間，在中國醫學科學院腫瘤醫院住院的60例肺癌患者及79名同期來院體檢的健康人血清中Linc00511的表達，分析其表達水平與臨床因素的關系，并評估其作為血清學標志物在肺癌臨床診斷中的應用價值。現報道如下。

1 對象與方法

1.1 研究對象

本研究回顧性采用本院79名健康人對照組血清樣本和60例肺癌組患者血清樣本為研究對象，對照組中男48名，女31名；平均年齡（56.43±9.07）歲。肺癌組中男35例，女25例；平均年齡（53.73±7.61）歲。入選對象一般資料組間比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。具有可比性。

1.2 納入與排除標準

納入標準：肺癌病例經病理診斷確診；收集血清樣本前未進行手術、放療和化療等相關治療；病例臨床診斷和腫瘤分期均按照美國癌癥聯合委員會癌癥的腫瘤-淋巴結-轉移（tumor-nodemetastasis，TNM）分期系統第六版或組織活檢及影像學檢查確定。排除標準：有肝、腎功能異常及其他嚴重基礎疾病、惡性腫瘤者。

1.3 方法

1.3.1 血清標本收集 收集所有研究對象靜脈血5 mL，室溫靜止1 h后，4℃，3 500 r/min離心10 min，用新管收集上層血清，4℃，12 000 r/min離心10 min，除去細胞碎片，將樣本置于-80℃冰箱中凍存。

1.3.2 RNA提取與逆轉錄 采用Trizol LS試劑（美國Invitrogen公司）從血清中提取總RNA，Mir-X miRNA First-Strand Synthesis and SYBR qRT-PCR試劑盒（日本Takara公司）進行cDNA合成，按試劑盒說明書進行操作，反應條件為：37℃、60 min，85℃、5 min，cDNA置于-20℃。

1.3.3 實時熒光定量PCR反應 qTOWER 3G 實時熒光定量PCR檢測系統（德國Jena公司）進行擴增，引物由Invitrogen公司合成，引物序列如下：GAPDHF：5’-CCTGGTATGACAACGAATTTG-3’；GAPDHR：5’-CAGTGAGGGTCTCTCTCTTCC-3’；Linc00511-F：5’-TCCTCACAGGGGGTAGTAGG-3’；Linc00511-R：5’-CCCTTCTCCCTCGGTCATTT-3'。PCR反應條件：95℃、10 s，95℃變性5 s，60℃、20 s，40個循環。每個樣品設置3個復孔，基因相對表達量采用2-ΔΔCt計算。

1.3.4 腫瘤標志物CYFRA檢測 采用全自動電化學發光免疫分析儀測定肺癌和健康對照組血清樣本中范圍為0～3.3 U/mL。

1.4 觀察指標

實時熒光定量PCR 檢測血清Linc00511表達水平；受試者工作特征（ROC）曲線、曲線下面積（AUC）、危險分數分析評估Linc00511對肺癌的診斷效能；計算靈敏度、特異度、陽性預測值（positive predictive value, PPV）和陰性預測值（negative predictive value, NPV），探討Linc00511獨立及聯合檢測在肺癌診斷中的應用價值。

1.5 統計方法

細胞角蛋白片段（cytokeratin fragmen, CYFRA）表達量具體數據通過查閱臨床病例資料獲得，采用SPSS 23.0統計學軟件進行數據，非正態分布的計量資料，以中位數（第25～75百分位數）[M（P25，P75）]表示，組間比較采用非參數檢驗。GraphPad Prism 6進行圖形繪制，并聯法進行聯合診斷。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 Linc00511在肺癌血清中高表達

實時熒光定量PCR檢測結果顯示，Linc00511在對照組血清中的相對表達量為0.787（0.397，1.643），在肺癌組血清中的相對表達量為1.933（1.315，3.229），明顯高于前者，差異有統計學意義（Z=-5.939，P＜0.001）。見圖1。

圖1 肺癌病例與正常血清中Linc00511的表達

2.2 Linc00511的血清表達量與臨床因素的關系

將肺癌組病例分別按照性別、年齡和是否遠處轉移情況進行分組，分析Linc00511的血清表達量的組間差異，結果顯示其血清表達水平在男性（n=35）和女性（n=25）患者血清中的表達量分別為（2.183±1.519）和（2.987±2.014），差異無統計學意義（t=-1.764，P=0.083）；在年齡＜60歲（n=21）和≥60歲（n=39）歲肺癌患者血清中的表達量分別為（2.260±1.534）和（2.393±1.937），差異無統計學意義（t=0.482，P=0.631）；Linc00511在M0肺癌患者（n=49）血清中的表達量為2.177（1.422，3.570），M1肺癌患者（n=11）血清表達量為1.432（1.219，1.876），二者比較差異有統計學意義（Z=-2.226，P=0.026），見圖2。

圖2 Linc00511的血清表達量與臨床因素的關系

2.3 Linc00511和CYFRA診斷肺癌的ROC曲線分析

將研究對象血清樣本的CYFRA檢測進行統計，結果顯示：肺癌組患者CYFRA表達量為2.805（2.085，4.930），對照組CYFRA表達量為2.040（1.470，2.880），兩組比較差異有統計學意義（Z=-4.119，P＜0.01），見圖3A，ROC曲線提示：CYFRA診斷肺癌的曲線下面積（AUC）為0.704（95%CI：0.618～0.790），Linc00511診斷肺癌ROC曲線AUC為0.806（95%CI：0.735～0.877，P＜0.01）。將Linc00511與CYFRA聯合檢測用于診斷肺癌，ROC曲線AUC為0.859（95%CI：0.799～0.920，P＜0.01），見圖3B。

圖3 Linc00511與CYFRA檢測肺癌ROC曲線分析

2.4 Linc00511和CYFRA診斷肺癌的效能分析

將Linc00511與腫瘤標志物CYFRA對肺癌的診斷效能進行比較，結果顯示，Linc00511診斷肺癌的特異度低于CYFRA，但其診斷的敏感度和NPV高于CYFRA，而二者聯合檢測的敏感度、特異度、PPV、NPV均高于CYFRA單獨檢測，見表1。

表1 Linc00511、CYFRA單獨及聯合檢測的臨床診斷效能

3 討論

我國是肺癌的高發病率國家，該病分別占男、女惡性腫瘤發病率的第1位和第2位，除影像學、病理學檢查外，血清標志物檢測是診斷該病重要的輔助檢查，常見的血清標志物有癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）、糖鏈抗原125（Carbohydrate antigen 125，CA125）、CYFRA等[5]，但目前尚未發現能夠準確早期診斷該病的單一標志物[6-8]，聯檢模式可提高診斷的效果，探究有價值的生物學標志物對腫瘤靶向治療具有重要意義。

眾多新方法的涌現，使Lnc RNAs在癌癥中的功能逐步被闡明[9-10]。Linc00511在多種腫瘤中表達失調，絕大多數文獻支持Linc00511可能作為癌基因發揮作用的觀點[11-13]，但Linc00511在惡性腫瘤中的生物學功能有待進一步研究。

目前，Linc00511在肺癌組織及相關細胞系中的表達研究較多，有關肺癌患者Linc00511血清學檢測的研究國內未見報道，Chunlin Li等[14]的研究采用qPCR檢測非小細胞肺癌患者（62例）和對照組（62例）血清Linc00511的表達水平，并對其分析比較，結果提示肺癌患者中Linc00511的表達明顯高于健康對照組（P＜0.05），本研究分析60例肺癌組與79名健康對照組血清Linc00511的表達量，結果同樣提示肺癌組Linc00511表達高于對照組（P＜0.05），該結論與前述研究結論具有良好的一致性，此外，本研究還提示受試者血清Linc00511的表達不受性別、年齡因素影響，但與患者轉移情況有關（P＜0.05），因此，Linc00511有可能作為肺癌的診斷乃至預后評估的指標。

CYFRA是目前臨床上常用的診斷肺癌的血清學指標之一[15]，本研究通過查閱病歷資料，繪制Linc00511與CYFRA診斷肺癌的ROC曲線并進一步分析二者單獨診斷和聯合診斷效能，結果提示，二者聯合檢測靈敏度和特異度分別為53.3%和88.6%，高于CYFRA單獨檢測的41.7%和82.3%；PPV和NPV分別為78.0%和71.4%，高于CYFRA單獨檢測的64.1%和65.0%，即Linc00511與CYFRA聯合檢測診斷效能高于CYFRA單獨檢測。因此Linc00511在肺癌的診斷中可能具有一定的臨床應用價值。

綜上所述，本研究通過檢測Linc00511在肺癌患者血清中的表達水平，分析其與肺癌臨床病理特征的關系，探討其單獨檢測及與CYFRA聯合檢測在肺癌診斷中的臨床價值，為肺癌的分子診斷提供實驗依據。但是，研究對Linc00511在肺癌診斷中的臨床價值只是做了粗淺探討，研究樣本數量十分有限，對Linc00511與肺癌其他病理學特征（如家族史、吸煙史、腫瘤分化程度、病理分期等）的相關性并未進行深入分析，Linc00511在肺癌中發揮作用的分子機制研究部分也尚未深入探討，這些還需進行更深入、系統的后續實驗研究來證實。