外源復合酶制劑對發酵后茄芯煙葉品質的影響

琚紹煊，時向東，王駿，王俊，劉路路，蔡興華，郭文龍，丁松爽

(1. 河南農業大學煙草行業栽培重點實驗室，河南鄭州 450002；2. 浙江中煙工業有限責任公司技術中心，浙江杭州 310024；3. 四川省煙草公司德陽市公司，四川德陽 618400；4. 四川中煙工業有限責任公司長城雪茄廠，四川德陽 618400)

茄芯是決定雪茄抽吸時吃味和香氣風格特征[1]的核心部分，對煙葉香氣風格、吃味、強度和勁頭等方面有較高要求[2]，但目前我國生產的茄芯煙葉多數缺乏濃郁香氣[3]。 而在煙葉發酵過程中，添加外源酶制劑不僅可以調控煙葉的內在化學成分，降低煙堿含量，改善煙葉因栽培和調制措施不當造成的品質不足[4－6]，使煙葉香氣量明顯增加，減輕煙葉的雜氣和刺激性[7]，令吃味趨于醇和、干凈，煙葉總體質量得到提高，還可以加速煙葉的發酵進程，縮短煙葉發酵周期[8]。

在工業發酵中常用果膠酶、纖維素酶和蛋白酶等作為外源酶制劑。 胡捷等[9]在雪茄煙葉發酵過程中添加果膠酶，得到的雪茄煙葉苦味明顯改善，總體品質提高。 經纖維素酶處理的上部煙葉香氣質增加，雜氣和刺激性降低，感官品質提高[10，11]。 寇明鈺等[12]用中性蛋白酶處理的雪茄煙葉化學成分更加協調，感官質量得到改善。 鄭霖霖等[13]對雪茄茄芯煙葉噴施果膠酶、纖維素酶和中性蛋白酶進行發酵，結果煙葉化學成分協調性得到改善，感官品質得以提高。

酶具有專一性，對所作用的底物有嚴格的選擇性。 一種酶只能催化某一類甚至只催化某一種化學物質發生反應。 研究認為煙葉發酵過程由多種酶共同催化作用[14，15]。 近年來，關于烤煙添加外源酶制劑來改善煙葉品質的研究較多，但是關于添加外源復合酶制劑改善雪茄煙葉品質的研究鮮有報道。 為此，本試驗以德雪3 號上部一級未發酵的茄芯煙葉為材料，研究雪茄煙葉發酵過程中添加外源復合酶制劑對發酵后茄芯煙葉品質的影響，以期篩選出改善其品質的外源復合酶制劑，繼而提高雪茄煙品質。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料為2020 年調制后的雪茄品種德雪3 號上部一級未發酵的茄芯煙葉，由四川中煙工業有限責任公司長城雪茄廠提供。 所用外源酶試劑:纖維素酶(10 000 U/g，上海麥克林生化科技有限公司產品)、果膠酶(30 000 U/g，上海麥克林生化科技有限公司產品)、中性蛋白酶(200 000 U/g，索萊寶生物科技有限公司產品)。

1.2 試驗設計與處理方法

試驗設計見表1，共8 個處理。 將不同外源酶制劑按試驗設計比例混合并溶于水，然后均勻噴施在調制后的雪茄煙上部葉表面，并以噴施同等體積的蒸餾水作對照，使平均回潮含水率30%左右，平衡水分24 h。 之后于2021 年7—8 月在四川省煙草公司德陽市公司進行人工堆積發酵，煙堆長1.86 m、寬2.0 m、高1.35 m，將處理的樣品放在煙堆中間位置。 在煙堆0.4、0.7、1.0 m 高度的平面中心位置放入精創GSP－6 溫濕度自動記錄儀，當垛心溫度顯示達到50℃時，按照上翻下、外翻內的原則進行煙葉翻堆并重新堆垛。 整個發酵過程進行30 d、4 次翻堆，發酵環境溫度27 ～33℃、濕度68%～75%。 發酵結束后的指標測定和感官質量評價采用半葉法:取完整葉片的一半于40℃下烘干，研磨過60 目篩保存，用于化學成分和中性致香物質成分的測定；取另一半煙葉手工卷制成雪茄，用于感官質量評價。 每處理重復3 次。

表1 試驗設計

1.3 測定項目及方法

1.3.1 常規化學成分測定 參照YC/T 159—2002[16]、 YC/T 161—2002[17]、 YC/T 249—2008[18]、YC/T 468—2013[19]的方法分別測定煙葉總糖、還原糖、總氮、蛋白質和煙堿含量(質量分數)。

1.3.2 中性致香物質測定 香氣物質提取及定性定量分析采用HP5890－5972 氣相色譜質譜儀。在同時蒸餾萃取裝置的一端接盛有20 g 煙樣(過60 目篩)、2 g 檸檬酸、600 mL 蒸餾水的1 000 mL圓底燒瓶，使用恒溫電熱套進行加熱；裝置的另一端接盛有40 mL 二氯甲烷和1 mL 內標的250 mL圓底燒瓶，該端燒瓶置于恒溫水浴鍋中加熱，水浴溫度為60℃。 同時蒸餾萃取2.5 h。 萃取完成后，加入10 g 左右無水硫酸鈉干燥有機相，然后于60℃水浴中濃縮至1 mL 左右即得煙葉精油。 將提取液由GC/MS 鑒定結果和NIST 庫檢索定性。

1.3.3 感官質量分析 將發酵后的另一半煙葉樣品手工卷制成長度110 mm、直徑14 mm 的雪茄煙支，置于溫度18℃、相對濕度70%的Binder恒溫恒濕箱中醇化養護4 個月供評吸使用。 評吸由河南農業大學國家煙草栽培生理生化研究基地組織國內雪茄工業企業有關專家完成。 評價方法采用湖北中煙三峽卷煙廠9 分制標準，對煙葉香氣質、香氣量、余味、雜氣、甜潤感、刺激性、燃燒性、灰色8 個指標進行感官質量評價，滿分100分。 按下式計算總分，總分越高代表煙葉感官質量越好。

式中:T 為感官質量評價得分；Pi為某單項指標權重(香氣質18%、香氣量16%、余味16%、雜氣10%、甜潤感10%、刺激性12%、燃燒性10%和灰色8%)，為某單項指標平均得分。 評價標準如表2 所示。

表2 雪茄煙葉感官質量評價標準

1.4 數據處理與分析

利用Microsoft Excel 2019 對樣品常規化學成分變化趨勢、中性致香物質含量和感官質量評價得分進行圖表制作；利用IBM SPSS Statistics 21軟件對樣品的化學成分進行多重比較，并對外源復合酶制劑用量與常規化學成分和中性致香物質進行主成分分析。

2 結果與分析

2.1 外源復合酶制劑對茄芯煙葉發酵后常規化學成分含量的影響

由圖1 可知，外源酶制劑處理下發酵后煙葉總氮含量有所增加，各處理總氮含量均顯著高于CK，NC 處理煙葉總氮含量隨著纖維素酶濃度的增加呈上升趨勢。 各處理發酵后煙葉蛋白質含量均降低，說明添加外源中性蛋白酶可以有效降低發酵后煙葉蛋白質含量，其中NC2 處理煙葉蛋白質含量最低，較CK 下降18.09%，達顯著水平。各處理發酵后煙葉煙堿含量均有所下降，N 處理與CK 無顯著差異；NP 處理中，NP1 處理煙葉煙堿含量顯著低于N 處理，NP2、NP3 與N 處理無顯著差異，表明外源復合酶制劑中低濃度果膠酶可以降低發酵后煙葉中的煙堿含量；NC1、NC2、NC3 處理煙葉煙堿含量均顯著低于N 處理，其中NC2 處理最低，為1.96%

圖1 不同處理發酵后茄芯煙葉總氮、蛋白質和煙堿含量

由圖2 可知，經外源復合酶制劑處理后煙葉總糖和還原糖含量均有所上升，且相同外源酶制劑處理的茄芯煙葉發酵后還原糖與總糖含量變化趨勢基本一致。 NP、NC 處理煙葉總糖和還原糖含量均隨著果膠酶和纖維素酶濃度的增加而增加。 所有處理中NC3 總糖、還原糖含量顯著高于其它處理，表明外源復合酶制劑中纖維素酶濃度越大，發酵后煙葉總糖和還原糖含量越高。

圖2 不同處理發酵后茄芯煙葉總糖和還原糖含量

2.2 外源復合酶制劑對發酵后煙葉中性致香物質含量的影響

各處理發酵后茄芯煙葉共檢測出26 種對煙葉香氣成分有較大影響的中性致香物質，其中棕色化反應產物5 種、苯丙氨酸轉化產物4 種、類胡蘿卜素降解產物15 種、西柏烷類降解產物1 種和葉綠素降解產物1 種。

2.2.1 對葉綠素降解產物和西柏烷類降解產物的影響 測得的26 種中性致香物質中，葉綠素降解產物新植二烯的含量最高。 新植二烯可以增加煙的吃味和香氣，進入煙氣時具有減少刺激和醇和香氣的作用[21]。 由表3 可知，各處理發酵后煙葉新植二烯含量均高于CK，且所有處理中新植二烯含量最低的是NP2 處理，NC 處理中纖維素酶濃度越大煙葉新植二烯含量越高，最高達332.23 μg/g，比CK 增加167.16%。 表明，煙葉噴施外源酶制劑可以增加發酵后煙葉新植二烯含量，且除NP2 外其它復合酶制劑處理煙葉新植二烯含量均高于單酶制劑處理，以纖維素酶和中性蛋白酶復合酶制劑處理效果較好。

表3 不同處理發酵后雪茄煙葉的葉綠素降解產物及西柏烷類降解產物含量(μg/g)

西柏烷類降解產物茄酮是煙草中含量最為豐富的中性香味物質之一，具有特別的香味。 NC3處理發酵后煙葉茄酮含量最高，達到28.84 μg/g。

2.2.2 對類胡蘿卜素降解產物含量的影響 類胡蘿卜素降解產物中β－大馬酮、β－二氫大馬酮等高沸點酮類物質具有明顯的致香作用[22]。 由表4 可知，除β－環檸檬醛外，各處理煙葉各種類胡蘿卜素降解產物含量均比CK 明顯增加。 其中NC3 處理法尼基丙酮含量增幅最大(92.55%)，β－大馬酮含量最高，達到3.09 μg/g；煙葉β－二氫大馬酮含量N 處理只有3.22 μg/g，低于其它外源復合酶制劑處理，NP1 處理含量最高，為4.82 μg/g。 從總量看，外源酶制劑處理發酵后煙葉類胡蘿卜素降解產物含量均有所升高，NP1 處理與CK 相比增幅最大，而NP2 增幅較小，僅有45.76%。 由此可見，150 U/g 中性蛋白酶和90 U/g 果膠酶復合制劑對類胡蘿卜素降解產物總量的影響較大。

表4 不同處理發酵后雪茄煙葉的類胡蘿卜素降解產物含量(μg/g)

2.2.3 對苯丙氨酸轉化產物含量的影響 由表5可知，4 類苯丙氨酸轉化產物中苯乙醇含量最高，且在所有處理中NP1 含量最高，達到8.89 μg/g，較CK 增加184.03%。 除苯乙醇外，苯甲醇也具有明顯的增香作用，已用于煙草加香[22]。 處理后的煙葉，苯甲醇增幅最大達到208.13%(NP1)。總體來說，外源復合酶制劑處理煙葉苯丙氨酸轉化產物總量均高于單酶制劑處理，其中NP1 處理含量最高，為23.20 μg/g。

表5 不同處理發酵后雪茄煙葉的苯丙氨酸轉化產物含量(μg/g)

2.2.4 對棕色化反應產物含量的影響 棕色化反應產物含有許多優質煙草的致香成分[23]。 由表6 可知，NC 處理中隨纖維素酶濃度增加，煙葉糠醛含量呈上升趨勢，最高達9.07 μg/g；各處理煙葉糠醇含量與CK 相比均有所升高，且NP、NC處理煙葉糠醇含量高于N 處理。 總體來說，外源酶制劑處理發酵后煙葉棕色化反應產物總量增加，且外源復合酶制劑處理高于中性蛋白酶處理。這可能是因為果膠酶和纖維素酶將煙葉中的果膠和纖維素降解為還原糖，與中性蛋白酶降解蛋白質產生的氨基酸結合，發生棕色化反應，使煙葉棕色化反應產物含量增加。

表6 不同處理發酵后雪茄煙葉的棕色化反應產物含量(μg/g)

2.3 發酵后雪茄煙葉內在品質指標的主成分分析

對測得的26 種中性致香物質和總糖、還原糖、總氮、蛋白質和煙堿5 種常規化學成分進行主成分分析[24]，提取特征值大于1 的主成分，得到4個主成分(表7)。 可知，4 個主成分的方差貢獻率分別是74.703%、9.445%、6.215%和3.897%，累積方差貢獻率達到94.261%，即代表其總信息的94.261%。 這樣就能保留煙葉大部分香氣成分和常規化學成分指標的絕大部分信息，將原來的31個品質指標轉化為4 個不相關的綜合指標，達到了降維的目的。

表7 特征值與累積貢獻率

表8 為前4 個主成分的載荷矩陣。 可以看出，第一主成分PC1 的方差貢獻率為74.703%(表7)，主要以巨豆三烯酮2、芳樟醇、β－二氫大馬酮、法尼基丙酮等類胡羅卜素降解產物的影響為主；第二主成分PC2 的方差貢獻率為9.445%，主要以煙葉常規化學成分中蛋白質含量的影響為主；第三主成分PC3 和第四主成分PC4 的方差貢獻率分別為6.215%、3.897%，主要以總糖、還原糖和茄酮的影響為主。 總的來說，PC1 和PC2 對煙葉內在品質的貢獻較大， 累積貢獻率達到84.148%。

表8 主成分的載荷矩陣

由表9 可知，NP1 處理(150 U/g 中性蛋白酶和果膠酶90 U/g)發酵后煙葉主成分綜合得分最高，煙葉綜合品質最優，其次為NC3 處理(150 U/g中性蛋白酶和150 U/g 纖維素酶)，這與感官質量評價結果一致。

表9 不同處理煙葉主成分得分

2.4 外源復合酶制劑處理發酵后煙葉的感官質量評價

將堆垛發酵后的煙葉進行評吸，感官質量評價結果如圖3。 可知，外源酶制劑處理發酵后煙葉的香氣質提升，香氣量增加，雜氣減少，刺激性有所下降，甜潤感增加。 其中NP1、NP3、NC3 處理發酵后煙葉的香氣質均優于其它處理，NP1、NC3 處理煙葉刺激性明顯下降。 NC3 處理香氣質稍好，香氣量尚充足，刺激性、雜氣均小于其它處理，感官質量綜合評價最高。

圖3 不同處理發酵后茄芯煙葉感官質量評價得分圖

3 討論

煙葉經酶促發酵處理，能有效引起煙葉常規化學成分的變化[8]。 有研究表明，外源酶制劑處理可以促進煙葉總氮的降解[20]。 本研究中，添加外源復合酶制劑處理發酵后茄芯煙葉總氮含量與對照相比有所上升，與前人研究結果相悖，這可能與酶本身就含氮及酶制劑噴施激活氮代謝相關酶活性等[10]有關。 煙葉噴施中性蛋白酶制劑可有效降解煙葉蛋白質含量[13，25]，煙葉噴施外源酶制劑可以增加煙葉總糖、還原糖含量[26－29]。 本研究中，果膠酶和纖維素酶與中性蛋白酶的復合酶制劑處理其煙葉發酵后總糖、還原糖含量增加，這與李曉等[30]用果膠酶、纖維素酶單獨處理效果一致。 此外，復合酶制劑處理的發酵后煙葉煙堿含量有所下降，與吳薇等[10]的研究結果相同，這可能是因為煙葉噴施酶制劑影響到煙堿代謝相關酶的活性，進而促進煙堿降解。

本試驗共提取出26 種中性致香物質，其中含量最高的是葉綠素降解產物新植二烯，其次是類胡蘿卜素降解產物，與郭文龍等[31]測得的結果一致。 經外源復合酶制劑處理的發酵后煙葉棕色化反應產物、類胡蘿卜素降解產物和苯丙氨酸轉化產物含量增加，這與于建軍等[27]的研究結果一致。 其原因可能是:外源復合酶制劑在煙葉發酵過程中促進蛋白質的降解，生成游離的氨基酸、短肽等小分子物質，參與棕色化反應而生成致香物質[32]；此外，某些具有特殊結構的多肽鏈可能增加類胡蘿卜素與氧氣分子的碰撞幾率，從而促進類胡蘿卜素的氧化降解，生成致香物質[33]；并且，外源復合酶制劑可以使煙葉中的果膠質和纖維素降解，產生還原糖類物質，增加參與棕色化反應的底物，還可以加速苯丙氨酸的代謝，使苯甲醇、苯乙醇等致香成分含量顯著升高。 經外源復合酶制劑處理的發酵后煙葉中性致香物質總量明顯增加，這可能是因為不同酶共同作用，促進煙葉中的大分子物質分解，加速各種酶促反應，從而導致致香物質的前體物轉化和積累[26，34]。

主成分分析是通過將單位不同的原始數據進行標準化，使其各項指標數量級保持一致，再將這些信息重疊的指標通過少數幾個主要指標反映出來，進而對這些指標進行綜合評判[35]。 本研究中，主成分綜合評價的結果與各處理感官質量評價排名結果基本一致，表明主成分分析可以應用于外源復合酶制劑處理發酵后煙葉質量的評價。

從本研究結果推測得出，可以結合不同煙葉自身的情況和不同復合酶制劑對煙葉感官質量的影響來選擇復合酶制劑，也可以根據不同酶制劑對不同化學成分、不同中性致香物質含量的影響選擇不同的復合酶制劑，以便有針對性地改善煙葉化學成分和提高煙葉的中性致香物質含量，從而改善煙葉的感官品質，提高煙葉質量。 但是，酶制劑均為蛋白質溶液，本身也受溫度、濕度、pH 等條件的影響[10]，因此，發酵環境是否為酶制劑的最佳反應環境、如何設定反應條件使各種酶充分發揮作用、工業上對大量煙葉處理時如何降低外源酶制劑的成本等問題仍需要繼續探究。 此外，煙葉在堆積發酵過程中存在微生物、酶與氧氣及氧自由基的共同作用，從而產生協調煙葉內在化學成分、改善煙葉感官評吸質量的效果。 添加酶制劑僅僅是改善其中一種影響因素，關于發酵過程中微生物、氧自由基的作用對煙葉品質的影響還需要進一步研究。

4 結論

添加外源復合酶制劑有利于發酵后雪茄茄芯煙葉蛋白質降解和轉化，提高中性致香物質含量。主成分分析結果顯示，外源添加150 U/g 中性蛋白酶和90 U/g 果膠酶復合制劑處理(NP1)發酵后煙葉綜合品質得分最高，其次為NC3 處理(150 U/g 中性蛋白酶和150 U/g 纖維素酶)。 感官質量評價NC3 處理總得分最高，最有利于提高發酵后茄芯煙葉品質。