五種昆蟲脫皮抑制劑與萊氏綠僵菌的相容性研究

張希鵬，王世賢，李學文，于妙榮，聶玉恒，任憲鑾，劉守柱

(1. 聊城大學農學與農業工程學院， 山東聊城 252000；2. 福建農林大學植物保護學院，福建福州 350002)

昆蟲病原真菌是最早被鑒定為昆蟲病原的微生物，也是一種可開發為環境友好型生物農藥的重要資源。 如今越來越多的昆蟲病原真菌，如球孢白僵菌(Beauveria bassiana)[1－3]、金龜子綠僵菌(Metarhizium anisopliae)[4－6]、 淡紫擬青霉(Paecilomyces lilacinus)[7]等被廣泛應用于農田、溫室等的害蟲防治中。 大量研究表明，利用昆蟲病原真菌防治害蟲不但對環境友好，而且不會引起害蟲的抗藥性，不殺傷天敵，對人畜安全，是一種綠色有效的方法[8－10]。 萊氏綠僵菌(M.rileyi)是一種昆蟲病原真菌，其寄主范圍廣泛，可以寄生在30 多種鱗翅目害蟲上[11－13]，自然條件下可在害蟲種群內形成侵染循環，引起昆蟲的田間流行病，能夠有效降低種群密度，具有很強的致病力，是極具開發潛力的蟲生真菌之一。

不同病原真菌的殺蟲效果差異較大，并容易受到環境影響[14，15]。 雖然綠僵菌制劑已被聯合國糧食與農業組織(FAO)推薦為環保產品并推廣應用[16，17]，但與其他真菌一樣，萊氏綠僵菌也存在擊倒害蟲時間長、殺蟲速率低下、受環境影響較大等弊端，尤其當蟲口密度較大時，不能及時壓低蟲口、減少損失。 為了提高殺蟲效果，現階段多將萊氏綠僵菌與其他藥劑混用以達到增強致病力的目的，但蟲生真菌與化學農藥的混用不能盲目進行，需要提前進行二者的相容性測定。 已有研究表明，昆蟲病原真菌與大部分化學農藥相容性較差[18－22]，與綠色農藥的相容性較好[23，24]，因而綠色農藥與昆蟲病原真菌復配是未來的應用方向。

虱螨脲、氟啶脲等是作用于昆蟲脫皮過程的一種綠色農藥，具有低毒、低殘留的特點，對人和牲畜相對安全，對環境友好，且害蟲對其不易產生抗性，已成為當前農林害蟲綜合治理中不可或缺的重要組成部分。 為明確萊氏綠僵菌與虱螨脲等綠色農藥混用的可能性，本試驗選擇5 種常用昆蟲脫皮抑制劑，研究該類藥劑與萊氏綠僵菌的相容性，并篩選相容性好的藥劑，為下一步與萊氏綠僵菌的復配提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試菌株:萊氏綠僵菌Nr5772 菌株，源自于美國佛羅里達大學昆蟲病理實驗室，并在聊城大學昆蟲實驗室內用薩氏麥芽糖酵母瓊脂固體培養基(SMAY)培養，－20℃冷藏保存。 由于長時間人工培養菌株會出現毒力衰退的現象，為保證其毒力，試驗開始前先接種到草地貪夜蛾幼蟲體內，幼蟲死亡后從僵蟲上分離孢子，純化、復壯后備用。

SMAY 培養基:蛋白胨5 g、麥芽糖5 g、酵母粉5 g、瓊脂6 g，用蒸餾水定容至500 mL，121℃滅菌20 min。

昆蟲脫皮抑制劑:94%氟啶脲、98%虱螨脲、94%氟鈴脲、95%滅幼脲和98%吡丙醚，均為原藥，由青島瀚生生物科技股份有限公司提供。

1.2 試驗方法

1.2.1 藥劑劑量設置 在中國農藥信息網查找5種供試藥劑的田間使用劑量，以田間使用劑量為基準，設置4 倍、2 倍、1 倍、50%、25%共5 個濃度梯度，以丙酮作為溶劑，配制各濃度藥液(表1)。

1.2.2 脫皮抑制劑對萊氏綠僵菌菌絲生長的影響 取復壯完成的萊氏綠僵菌新鮮孢子，用0.1%吐溫80(無菌水配置)配制濃度為1×106個/mL的分生孢子懸浮液待用。 根據表1 配制各濃度藥劑，移液槍吸取300 μL 藥液加入SMAY 平板中，并用玻璃棒涂布均勻，以涂布丙酮為對照。 靜置10 min 待丙酮完全揮發后，用移液槍將分生孢子懸浮液接種至不同平板中，每皿接種3 滴，每滴3 μL(液滴圓形)，液滴呈三角形排列。 靜置20 min密封平板，將平板置于光照培養箱內培養(25℃，光周期L ∶D＝12 h ∶12 h)。 每個藥劑濃度重復3次。

培養第4 天后平板出現較為明顯的菌落，采用十字交叉法測量各菌落直徑，以每皿3 個菌落直徑的平均值作為菌落的原始直徑，以第14 天平均菌落直徑作為最終值，計算菌落直徑增長量。

菌落直徑增長量(cm)＝第14 天菌落平均直徑－第4 天菌落平均直徑。

1.2.3 昆蟲脫皮抑制劑對萊氏綠僵菌產孢量的影響 基于1.2.2 菌落直徑測定完成后，用0.1%吐溫80 將每皿平板內的所有孢子充分洗脫，轉移至離心管內定容至10 mL，漩渦振蕩器上充分混勻后過濾，在顯微鏡下用血球計數板計數。 每個濃度處理取3 皿平板，計數平均產孢量，計算產孢抑制率。

產孢抑制率(%)＝(對照組產孢量－處理組產孢量)/對照組產孢量×100 。

1.2.4 昆蟲脫皮抑制劑對萊氏綠僵菌孢子萌發的影響 取新鮮綠僵菌孢子，用0.1%吐溫80 配制成濃度為1×108個/mL 的分生孢子懸浮液備用。 稱取100 mg 原藥，加入2 mL 吐溫80 充分攪拌至糊狀，然后加入少量丙酮攪拌至完全溶解，加入0.1%吐溫80 定容至50 mL，配制成高濃度的藥劑母液備用。 取適量藥劑母液，用孢子懸浮液分別稀釋成田間劑量4 倍、2 倍、1 倍、50%、25%濃度的梯度藥液(表1)，以不含藥的液體作為對照，180 r/min、25℃搖床振蕩培養48 h 后用血球計數板統計孢子萌發數量，每濃度重復3 次，計算孢子萌發抑制率。

孢子萌發抑制率(%)＝(檢查的總孢子數－萌發孢子數)/檢查的總孢子數×100 。

1.3 數據處理與分析

試驗數據用SPSS 26.0(IBM)軟件進行分析處理，采用Duncan’s 新復極差法分析比較差異顯著性(P＜0.05)，用Graphpad Prism 8 作圖。

2 結果與分析

2.1 5 種昆蟲脫皮抑制劑對萊氏綠僵菌菌絲生長的影響

萊氏綠僵菌孢子接種到帶藥平板后，第4 天左右即可見到明顯菌斑，此后菌絲越來越濃密，菌落直徑緩慢增大，與對照相比，菌落直徑沒有明顯變化，說明在供試劑量范圍內，萊氏綠僵菌在5 種藥劑平板中均可生長。 對各處理的菌落增長量進行方差分析，結果表明，各藥劑不同濃度處理與對照間的菌落直徑差異均不顯著(圖1)，說明萊氏綠僵菌對5 種昆蟲脫皮抑制劑的敏感性不強，適應范圍比較廣，即使在4 倍田間劑量下菌絲的營養生長依然沒有受到抑制。

圖1 萊氏綠僵菌經5 種昆蟲脫皮抑制劑處理的菌落直徑增長量

2.2 5 種昆蟲脫皮抑制劑對萊氏綠僵菌產孢量的影響

數據分析結果(圖2)表明，氟啶脲、虱螨脲和滅幼脲3 種藥劑處理的產孢量較高，與對照組無顯著差異，說明在試驗劑量范圍內，這3 種藥劑對萊氏綠僵菌的生殖生長沒有不利影響。 氟鈴脲和吡丙醚處理的孢子產量較低，在25%田間劑量濃度下，抑制率分別為66.97%、39.74%，在田間劑量濃度下抑制率分別為68.92%、54.50%，在4 倍田間劑量濃度下抑制率分別為83.70%、61.05%；各濃度處理均顯著低于對照組，并呈現藥劑濃度越高抑制性越強的趨勢。

2.3 5 種昆蟲脫皮抑制劑對萊氏綠僵菌孢子萌發的影響

氟啶脲、虱螨脲和滅幼脲3 種藥劑各濃度處理孢子均正常萌發，萌發量與對照組無顯著差異，虱螨脲甚至還呈現出隨著濃度的升高促進孢子萌發的現象(圖3)。 氟鈴脲和吡丙醚處理的孢子萌發數量顯著低于對照組，表現出較強的抑制性，且隨著藥劑濃度升高，對孢子萌發的抑制作用越強。在25%～4 倍田間濃度下，氟鈴脲對萊氏綠僵菌孢子的萌發抑制率為39.08%～68.69%，吡丙醚的抑制率為35.06%～60.45%。

圖3 萊氏綠僵菌經5 種昆蟲脫皮抑制劑處理的孢子萌發量

3 討論與結論

害蟲防治一直是農業生產中的重要內容，也是農業豐產、豐收的重要保障。 目前對農業害蟲的防治主要還是大量采用化學藥劑，但化學農藥使用的弊端日趨明顯，不符合綠色農業、生態農業的發展趨勢，因而亟需開發環境友好的綠色新型農藥。 隨著農業技術的發展，越來越多的真菌制劑、植物農藥等綠色農藥相繼問世，其中以白僵菌、綠僵菌為代表的真菌類生物農藥，以其良好的防治效果和安全性而得到廣泛應用。 我國從20世紀70 年代就開始運用綠僵菌防治農業害蟲[25]，在綠僵菌的應用和研究方面積累了豐富經驗。 但是真菌殺蟲劑存在見效慢和受環境影響大的缺點，這阻礙了綠僵菌的進一步應用。

解決昆蟲病原真菌殺蟲速度慢的措施之一是與化學農藥復配使用。 李敏等[26]研究發現，昆蟲真菌與殺蟲劑的相容性高于與殺菌劑的，且低濃度優于高濃度；與化學藥劑復配后對真菌的防治效果也具有一定的增效作用[27，28]。 昆蟲脫皮抑制劑作為一類作用機制獨特的綠色農藥，不但在生產上有廣泛的應用，而且也是常用的復配藥劑，但該類藥劑與昆蟲病原真菌的復配卻鮮有研究。與昆蟲脫皮抑制劑聯合使用是提高萊氏綠僵菌殺蟲速度的新途徑，但首先需要明確二者之間有無抑制或拮抗作用。

本研究選擇了5 種可以延緩或抑制昆蟲脫皮的藥劑，從菌落直徑、孢子產量、孢子萌發量三方面評估藥劑與萊氏綠僵菌的相容性。 結果表明，氟啶脲、虱螨脲和滅幼脲與萊氏綠僵菌的相容性較好，對菌絲生長、產孢量和孢子萌發均沒有抑制作用，虱螨脲還可以在一定程度上促進孢子萌發，因而可以與萊氏綠僵菌復配使用。 氟鈴脲和吡丙醚雖然對萊氏綠僵菌菌絲生長沒有抑制作用，但對孢子萌發和產孢量具有很強的抑制作用。 由于萊氏綠僵菌的致病機理主要是通過孢子萌發穿透體壁來侵染寄主[29]，而氟鈴脲和吡丙醚對孢子萌發具有很強的抑制性，會嚴重影響萊氏綠僵菌的侵染成功率，導致防治效果下降，因而不宜作為復配藥劑使用。

本研究結果表明，氟啶脲、虱螨脲和滅幼脲與萊氏綠僵菌均有很好的相容性，下一步可以進行兩者的復配研究以提高萊氏綠僵菌的殺蟲效率，既滿足現代農業對生物防治手段的要求，又可以提高生產效率和產品品質。 此外，本研究也可為其他病原真菌，如白僵菌的復配應用提供新的研究思路，對提高生物防治效果、減少化學藥劑的使用具有深遠意義。