三葉青兩個受體蛋白基因的克隆及功能分析

林國衛(wèi)，武思夢，張悅，蔡紅，聞靜

(1. 上饒師范學院生命科學學院，江西上饒 334000；2. 玉山縣紅日農(nóng)林農(nóng)民專業(yè)合作社，江西玉山 334700)

三葉青(Tetrastigma hemsleyanuDiels et Gilg.)在我國有著悠久的民間藥用歷史，塊根是其重要的藥用部位，富含黃酮類[1]、多糖類[2]、酚酸類[3]及脂肪酸類[4]等多種次生代謝物質，其提取物具有消炎、抗病毒、解熱及抗腫瘤等功效[5，6]。 由于三葉青在自然環(huán)境中生長緩慢，僅靠自然繁殖已不能滿足市場需求，開發(fā)快繁及人工栽培技術對于提高產(chǎn)量、保護種質資源及促進其生物學研究具有重要意義。 但三葉青組織培養(yǎng)中存在嚴重的再分化障礙，通過愈傷組織途徑很難形成再生芽或胚狀體，目前只能通過芽原基無菌培養(yǎng)增殖實現(xiàn)快速繁殖[7，8]，這嚴重制約了轉基因技術在三葉青分子生物學基礎研究中的應用。 另外，三葉青塊根從纖維根到營養(yǎng)儲藏器官的轉變過程也涉及到體細胞的再分化。 研究表明胚狀體受體類激酶(somatic embryogenesis receptor kinases，SERKs)是參與植物營養(yǎng)儲藏器官形成的關鍵受體類蛋白[9]，在體細胞胚發(fā)生及體細胞的脫分化中發(fā)揮重要作用[10，11]。 因此，本研究從三葉青轉錄組數(shù)據(jù)庫中篩選到與SERKs 相似度最高的兩個受體蛋白基因ThRLP1及ThRLK1，通過生物信息學分析、原核表達分析、塊根發(fā)育不同時期及器官特異性表達分析等，初步明確其分子結構特征及表達特征，為進一步研究該類基因所涉及的生物學過程及其功能鑒定提供分子生物學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 植物材料 本研究所用三葉青為栽培品種“懷玉2 號”，由玉山縣紅日農(nóng)林農(nóng)民專業(yè)合作社提供。

1.1.2 試劑 針對富含多酚多糖植物組織的RNA 提取試劑盒Quik RNA Isolation Kit GK，購自北京華越洋生物科技有限公司；反轉錄試劑盒(TransScript?One－Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix)、基因克隆PCR 酶(2×TransTaq High Fidelity PCR SuperMixⅠ)及檢測PCRTaq酶(2×EasyTaq?PCR SuperMix)，均購自北京TRANSGENE 科技有限公司； 膠回收試劑盒(MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.4.0)、克隆載體(pMDTM18－T Vector Cloning Kit)及大腸桿菌DH5α 感受態(tài)，選用大連TAKARA 公司的產(chǎn)品；瓊脂糖、β-巰基乙醇、NaCl、Tris、EDTA等化學試劑采購于百化商城。

1.1.3 試驗儀器 MC nexus PCR 儀(德國，Eppendorf)，實時熒光定量PCR 檢測儀器(西安，天隆)，DYY－6E 型電泳儀(北京，六一)，Tanon 3500R 全自動數(shù)碼凝膠圖像分析系統(tǒng)(上海，天能)，微量蛋白測定儀(日本，Shimadzu)，高速離心機(德國，Sigma 2K15)，JY96－IIN 型超聲波細胞破碎儀。 由上海尼桑生物工程股份有限公司提供測序服務。

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品采集與處理方法 2022 年5 月15 日上午從懷玉山紅日農(nóng)林農(nóng)民專業(yè)合作社的溫室中(E117°58′17″，N28°53′51″)采集三葉青的健康功能葉、匍匐狀分枝(枝蔓)、膨大塊根、受精子房及頂芽，然后取葉片正中間1/4 大小作為葉片樣品，取兩片葉子中間的枝截取1/4 長度作為枝蔓樣品，取塊根中間部位約1/4 大小作為塊根樣品；受精子房取樣以子房膨大及花冠萎蔫為標準，取樣時去掉花托及萎蔫的花冠部分；頂芽取樣盡量去掉周圍的幼葉。 每種樣品取3 ～5 株，剪碎后混合，稱取100 mg，重復3 次。

不同發(fā)育時期塊根采樣參照聞靜等[12]的方法，樣品稱量后立即液氮速凍，于－80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 總RNA 的提取及cDNA 的合成 以頂芽為樣本，液氮研磨后提取總RNA，操作步驟參照RNA 提取試劑盒說明書。 對提取后的RNA 進行純度及定量分析，然后用70 ng/μL 的總RNA 作為樣本進行反轉錄合成cDNA，操作步驟參照反轉錄試劑盒說明書。

1.2.3ThRLP1和ThRLK1基因的克隆和測序根據(jù)前期從三葉青塊根及葉片轉錄組獲得的基因序列及注釋信息分析，設計ThRLP1及ThRLK1全基因擴增引物、開放讀碼框擴增引物及熒光定量引物(表1)。 PCR 反應體系為50 μL，反應成分及用量參照試劑盒說明書；反應程序為98℃變性5 s，56℃退火5 s，72℃延伸1.5 min，共35 個循環(huán)。 PCR 產(chǎn)物用1.2%～1.5%瓊脂糖TAE 凝膠電泳檢測，純化后與克隆載體連接，轉化大腸桿菌，菌落PCR 檢測后測序。

表1 用于ThRLP1 和ThRLK1 基因克隆及熒光定量分析的引物

1.2.4ThRLP1和ThRLK1基因的生物信息學分析 采用在線軟件進行相關分析，具體見表2。采用MEGA 7 進行多重比對后利用neighbor－joining 算法構建進化樹。

表2 生物信息學分析在線軟件名稱、用途及網(wǎng)址

1.2.5ThRLP1和ThRLK1基因表達的RT－qPCR分析 相對熒光定量采用染料法，反應不同組分用量及反應溫度條件參照熒光定量試劑盒說明書兩步法操作，反應體系為20 μL。 器官特異性表達檢測中采用ELF－α(MT731970)[12]為內(nèi)參基因，塊根發(fā)育不同時期的引物設計參考聞靜等[12]的方法，內(nèi)參基因為RPⅡ(MW307822)。 試驗設置生物學重復、技術重復各3 次。 數(shù)據(jù)分析采用2－△△Ct法[13]，差異顯著性分析采用SPSS 軟件的LSD 法。

1.2.6ThRLP1和ThRLK1基因的原核表達分析以ThRLP1及ThRLK1基因的開放讀碼框序列設計引物并進行PCR 擴增。 擴增片段回收后與原核表達載體連接，具體連接及轉化方法參考pEASY?－Blunt 載體說明書；轉入DH5α 抗生素篩選，經(jīng)擴大培養(yǎng)后提取質粒測序，選擇正確的重組原核表達載體序列轉化DE3 感受態(tài)，涂布在含有50 μg/mL 氨芐西林的固體LB 培養(yǎng)基上培養(yǎng)12 h；挑取單菌落擴大培養(yǎng)，菌液濃度達到OD600nm為0.45～0.60 時加入1 mmol/L IPTG 誘導蛋白表達，搖菌4 h 后取1～5 mL 菌液，4℃、12 000 r/min離心，收集菌體沉淀后冰上超聲波破碎，4℃、12 000 r/min 離心20 min，取上清進行SDSPAGE 檢測。

2 結果與分析

2.1 目的基因克隆

以懷玉山三葉青頂芽的cDNA 為模板擴增ThRLP1和ThRLK1基因的全長序列，凝膠電泳結果(圖1)顯示，擴增產(chǎn)物大小與預期接近。 經(jīng)測序得到的堿基序列與前期獲得的轉錄組序列相似度大于99%，推測的氨基酸序列與由轉錄組原序列推測的氨基酸序列相似度為100%。

圖1 ThRLP1 和ThRLK1 基因PCR 電泳檢測結果

2.2 ThRLP1 和ThRLK1 基因的生物信息學分析

2.2.1ThRLP1和ThRLK1基因推測蛋白質序列的生物信息學分析ThRLP1基因開放讀碼框長度為657 bp，預測編碼218 個氨基酸。 經(jīng)在線比對，蛋白序列與河岸葡萄(Vitis riparia)的富含亮氨酸的重復蛋白亞型1(leucine－rich repeat protein 1－like isoform X1，XP＿034694208.1)相似度最高，為94.50%，序列覆蓋率為100%。 特異匹配保守域分析結果(圖2)表明在第26 ～67 個氨基酸位點有N 端的亮氨酸重復序列(leucine rich repeat N－terminal domain，LRRNT＿2，pfam08263)，在第95～154 個氨基酸位點有亮氨酸富含區(qū)(leucine rich repeat，LRR＿8，pfam13855)。

圖2 ThRLP1 基因推測氨基酸序列的信號肽、保守氨基酸及保守域分析

ThRLK1基因開放讀碼框長度為399 bp，預測編碼132 個氨基酸；蛋白質序列與葡萄的SERK2(XP＿002276414.2)相似度最高，為96.97%，序列覆蓋率為100%；保守域分析結果(圖3)表明在第1～85 氨基酸位點有絲氨酸/蘇氨酸激酶的催化結構域(catalytic domain of the serine/threonine kinase，STK＿BAK1＿like)。

圖3 ThRLK1 基因推測氨基酸序列的保守氨基酸及保守域分析

ThRLP1和ThRLK1基因預測蛋白的分子量、等電點、分子功能及亞細胞定位等見表3。

表3 ThRLP1 和ThRLK1 蛋白的生物信息學分析結果

2.2.2ThRLP1和ThRLK1基因的進化分析 利用NCBI 數(shù)據(jù)庫的Blastp 比對，將ThRLP1 和ThRLK1及與其同源性較高的46 條蛋白通過neighbor－joining 構建系統(tǒng)進化樹。 由圖4 可見，所有蛋白被分為3 類，ThRLP1 和ThRLK1 分處于不同的類群，其中，ThRLP1 與葡萄的VvSERK1 和河岸葡萄的VrLRP1處于同一進化分枝，序列相似性最高；ThRLK1 與葡萄的VvSERK2 和河岸葡萄的VrBAK1 處于同一進化分枝，在系統(tǒng)發(fā)育中序列相似性最高。

圖4 ThRLP1 和ThRLK1 及其同源蛋白序列的系統(tǒng)進化樹

2.3 ThRLP1 和ThRLK1 基因的表達特征分析

2.3.1 兩基因在三葉青不同器官中的表達ThRLP1在三葉青塊根中的表達量顯著低于其他器官，而葉片、頂芽、受精的子房及枝蔓中該基因的表達差異不顯著(圖5A)。 在5 種器官中都檢測到了ThRLK1基因的表達，受精的子房中表達量最低，顯著低于其他器官；頂芽中的表達量略高于受精的子房，但明顯低于葉片、塊根中的表達水平；該基因在枝蔓中的表達量最高，顯著高于其他4 種器官(圖5B)。

2.3.2 兩基因在塊根發(fā)育不同時期的表達分析

由圖6 可見，ThRLP1在具有塊根的纖維根(Ⅳ)中表達量最高，且與其他發(fā)育狀態(tài)的根中的表達量差異顯著；其次為在纖維根期(Ⅰ)與塊根期(Ⅲ)，兩者間差異不顯著，但顯著高于塊根的初始膨大期(Ⅱ)。ThRLK1基因在具有塊根的纖維根(Ⅳ)中表達量最高，顯著高于纖維根期(Ⅰ)和塊根初始膨大期(Ⅱ)，但與塊根期(Ⅲ)差異不顯著；在纖維根期(Ⅰ)該基因的表達量最低，顯著低于塊根期(Ⅲ)與具有塊根的纖維根(Ⅳ)，但與塊根初始膨大期(Ⅱ)的表達量差異不顯著。

圖6 三葉青塊根發(fā)育不同時期ThRLP1(A)和ThRLK1(B)基因的相對表達量

2.4 ThRLP1 和ThRLK1 的原核表達分析

原核誘導表達分析結果(圖7)顯示，含有重組表達載體pEASY－ Blunt E1ThRLP1與pEASYBlunt E1ThRLK1的受體菌經(jīng)過4 h 的ITPG 誘導后，分別誘導表達出29 kD 與20 kD 左右的蛋白，與預測的目的蛋白大小相符。

圖7 ThRLK1(A)及ThRLP1(B)的原核表達SDS－PAGE 電泳結果

3 討論與結論

SERK 類蛋白已經(jīng)被證明在植物愈傷組織向體細胞胚發(fā)育過程中起到重要作用，如在唇蘭的組織培養(yǎng)中，在體細胞胚發(fā)育初期，ClSERK基因在由原球莖產(chǎn)生的胚性愈傷組織中高度表達[14]；Pérez－Nú?ez 等證實CnSERK表達與體細胞胚胎發(fā)生的誘導有關，是調控體外培養(yǎng)的椰子組織中形成體細胞胚胎的關鍵基因[15]。 典型的SERK類蛋白包含一個富含絲氨酸或脯氨酸的胞外結構域、一個跨膜結構域和一個胞內(nèi)激酶結構域[16，17]。 本研究結果表明ThRLP1基因所編碼的氨基酸序列富含亮氨酸殘基，具有類似LxxLxx-LxxLxLxN 的保守結構域及細胞外LRR 蛋白的特征結構基元Lt/sgxIP；該蛋白序列具有信號肽序列，但缺少質膜內(nèi)的激酶區(qū)域，所以ThRLP1 是一類細胞外受體蛋白[18]。 ThRLK1 不具有信號肽序列，缺少細胞外區(qū)域及跨膜區(qū)的保守域，但具有激酶特征的絲氨酸/蘇氨酸激酶的催化結構域，因此被稱為質膜受體類激酶[19]。 與已知胚狀體受體類激酶分子結構對比， ThRLP1 和ThRLK1 的蛋白序列只具有部分胚狀體受體類激酶保守域，通過進一步對三葉青塊根及葉片轉錄組中序列的篩選比對，并沒有發(fā)現(xiàn)同時具有細胞外LRR 氨基酸結構域及質膜受體結構域的SERK 類蛋白。 另外，ThRLP1具有SERK 的胞外結構及跨膜結構，而ThRLK1具有SERK 的膜內(nèi)激酶結構，項目組初期懷疑兩個基因可能來源于一個完整的SERK類基因片段，但是通過設計特異性引物擴增，并沒有得到預想的結構完整的SERK 類蛋白序列。 而與ThRLP1 和ThRLK1 蛋白序列相似性較高的葡萄中確實存在具有類似結構的同類蛋白質，因此本研究克隆的ThRLP1和ThRLK1基因可以作為進一步研究三葉青SERK 類蛋白質的對象。

本研究在器官特異性表達分析中發(fā)現(xiàn)ThRLP1在三葉青葉片、頂芽、受精后的子房、塊根及枝蔓中均有表達，與Sultana 等[20]發(fā)現(xiàn)擬南芥的細胞外LRR 類受體蛋白在器官中的表達較為普遍的結果類似；但塊根中的表達量顯著低于其他器官，推測該基因與塊根發(fā)育呈負相關性或相關性較小。 目前受體類蛋白參與根或地下儲藏器官發(fā)育的研究并不多見，Chen 等[21]研究發(fā)現(xiàn)富含亮氨酸受體蛋白(leucine－rich repeat RKs，LRRRKs)可以直接與根部頂端生長因子RGF(root meristem growth factor)作用，控制根頂端分生組織的發(fā)育。 而甜薯貯藏根組織mRNA 印跡分析表明，其受體類激酶SRF6 的mRNA 定位于木質部的初生形成層和分生組織周圍，控制貯藏根增厚[22]。 但細胞外受體類蛋白直接參與植物地下儲藏器官形成的報道還未見，目前植物胞外受體蛋白的研究主要集中在植物與病原互作的免疫反應過程[23，24]。

ThRLK1在三葉青各器官中也均有表達，且在頂芽及受精的子房中表達量較低，推測該基因與芽的發(fā)生過程相關性較小。 三葉青匍匐狀分枝是其主要的運輸器官，主要分布著疏導組織，Zhang等研究表明擬南芥的SERK家族受體類激酶與CLE41/TDIF－PXY 作為共同的受體調節(jié)植物維管束的發(fā)育[25]，而ThRLK1在三葉青枝蔓中的表達量最高，初步推測其可能與維管組織發(fā)育相關。Blümke 等研究表明擬南芥質膜受體激酶MAZZA與CLV1f 共同控制的信號轉導網(wǎng)絡控制根的發(fā)育[26]，但目前質膜類激酶參與到三葉青塊根發(fā)育的研究還未見報道。 本研究發(fā)現(xiàn)，雖然ThRLK1基因在三葉青塊根中的表達量低于枝蔓，但是在塊根和具有塊根植株的纖維根中表達量較高，推測其可能在塊根發(fā)育過程中起一定作用，具體作用機制還需深入研究。

植物器官再分化及體細胞胚發(fā)育是一個復雜的生物學問題，受到植物基因型及培養(yǎng)環(huán)境中激素、養(yǎng)分等諸多因素的調節(jié)。 本研究克隆的兩個三葉青受體類蛋白雖然與SERKs 蛋白序列相似度較高，但在芽與受精的子房中并無顯著的高豐度表達，在塊根中表達量也低于枝蔓。 因此，有關懷玉山三葉青SERK 類蛋白的鑒定及功能還有待進一步研究。