超高效液相色譜-串聯質譜法測定堅果中的黃曲霉毒素含量

李云萱，朱 帥，鄭仕劍

（浙江方圓檢測集團股份有限公司，浙江 杭州 310018）

近幾年，我國人民生活水平逐步提高，堅果已成為幾乎每日都在攝取的食物[1]，因此堅果的食品安全和人們的生活健康息息相關。由于堅果水分、水分活度、營養成分、pH 值和能長期貯存的特性導致其容易發霉。堅果中常見的可檢測到的真菌多是曲霉屬、根霉屬和青霉屬[2-3]。而堅果中經常出現潛在的產毒物種，如黃曲霉、寄生曲霉和黑曲霉[4-5]，這些霉菌種類是眾所周知的黃曲霉毒素的生產者，具有遺傳毒性和致癌性[6-7]。其中，黃曲霉毒素對免疫系統和生殖系統具有損傷性[8]，而黃曲霉毒素B1的毒性最烈，為氰化鉀的10 倍，砒霜的68 倍[9]，是目前受真菌污染的堅果中毒性最大、涉及面最廣的霉菌毒素之一。尤其在濕熱環境中發生幾率較高，易在玉米、花生、谷物、果仁、堅果等油脂含量較高的糧油作物上生長[10]。1993 年，黃曲霉毒素被世界衛生組織的癌癥研究機構確定為天然存在的一類致癌物質[11]。每年世界上約有25%的食物受黃曲霉毒素污染[12]。黃曲霉毒素是由真菌屬的黃曲霉和寄生曲霉等產生的一類帶有香豆素或雙呋喃環的化合物[13]。黃曲霉毒素對肝臟的毒性尤為明顯，過量攝入會導致肝炎、肝硬化和肝壞死等，除了對腎臟等器官的功能造成嚴重損外，還抑制生長發育、影響生殖代謝和免疫調節等[14]。

開心果、核桃和杏仁由于對身體健康有良好的功效而備受青睞。開心果可降低膽固醇水平并降低血壓[15]，減少身體氧化和炎癥壓力、控制血糖、更好地控制食欲并控制體重[16]。核桃仁中含有的亞油酸，則可預防和治療老年人血管疾病[17]。苦杏仁中的苦杏仁苷具有抑制和殺死癌細胞的作用[18]。因此，快速篩查堅果中真菌毒素含量，并保障其含量在國家標準范圍內成為一個與食品安全息息相關的問題。

目前，常用的黃曲霉毒素檢測方法有薄層色譜法[19]、熒光光度法[20-21]、酶聯免疫法[22-24]、高效液相色譜法[25-26]等。但上述方法前處理繁瑣、操作步驟多、雜質影響較大、易產生干擾，尤其黃曲霉毒素B1，柱前衍生所用試劑對操作者和環境都有一定危害，柱后衍生又需要專用的配套儀器，應用易受限制。與此同時，液相色譜-串聯質譜法越來越多應用于各類真菌毒素分析，并且使黃曲霉毒素的分析能力得到顯著提高，這主要得益于質譜的高靈敏度和定量能力，且還無需衍生，更可以同時對多種化合物進行定性定量分析。研究建立了用MycoSep226 多功能凈化柱凈化的高效液相色譜-串聯質譜法測定開心果、核桃和杏仁中的黃曲霉毒素。

1 儀器、試劑及方法

1.1 儀器設備

Sciex Triple Quad 5500 型三重四級桿液相色譜-串聯質譜儀，配有電噴霧離子源（ESI），美國AB 公司產品；Milli-Q Integral 型超純水儀，美國默克公司產品；ST16R 型高速冷凍離心機，Thermo Fisher 公司產品；HY-2A 型調速振蕩器，江蘇金壇榮華產品；VORTEX GENIUS3 型渦旋混合器，IKA 公司產品；DS-800DTH 型超聲波清洗器，上海生析超聲儀器有限公司產品。

1.2 標準品和試劑

黃曲霉毒素B1，B2，G1，G2（100 μg/mL），Dr.Ehrenstorfer 公司提供。

乙腈、甲醇（均為色譜純），德國Merck 公司提供；無水硫酸鎂（分析純），西隴科學股份有限公司提供；Z-Sep 凈化管，Supelco 公司提供；C18，深圳逗點生物技術有限公司提供；實驗室一級用水，符合GB/T 6682—2008《分析實驗室用水國家標準》；MycoSep226 凈化柱，美國Romer Labs 公司提供。

1.3 標準溶液的配置

黃曲霉毒素B1，B2，G1，G2標準工作液（100ng/mL）：準確移取黃曲霉毒素混合標準溶液0.10 mL 至100 mL容量瓶中，乙腈定容。此溶液密封后避光-20 ℃下保存，3 個月有效。

標準系列工作溶液：準確移取混合標準工作液（100 ng/mL） 50，100，200，500，1 000 μL 至10 mL容量瓶中，用空白萃取液定容至刻度，配置質量濃度為0.5，1.0，2.0，5.0，8.0，10.0 ng/mL。

1.4 樣品前處理

準確稱取處理好的樣品5.00 g（精確到0.01 g）于50 mL 具塞離心管中，加入20 mL 乙腈水（8∶2），渦旋1 min，振蕩10 min，以轉速8 000 r/min離心5 min，取上清液于裝有5 g 無水硫酸鈉、200 mg Z-SEP 的離心管中，振蕩2 min，以轉速8 000 r/min離心5 min。

取6 mL 上述離心后的提取液過MycoSep226 多功能凈化柱，舍去前2 mL，取后4 mL 凈化液40~50 ℃氮吹干，殘渣用1 mL 50%乙腈水定容，過0.22 m濾膜，待上機測定。

1.5 LC-MS/MS 儀器條件

液相色譜條件：WatersACOUITYUPLC? HSST3 型色譜柱（1.8 μm，2.1 mm×100 mm）；流動相：A 為乙腈，B 為0.1%甲酸水溶液；流速0.3 mL/min，柱溫30 ℃，進樣量5 μL。

梯度洗脫程序見表1。

表1 梯度洗脫程序

質譜條件：電噴霧離子源（ESI），正離子掃描，多反應監測（MRM） 模式，電噴霧電壓（IS） 5 500 V，離子源溫度（TEM） 550 ℃，碰撞氣（CAD，N2） 壓力41.3 kPa（6 Psi），氣簾氣（CUR，N2） 壓力206.8 kPa（30 Psi），霧化氣（GS1，N2） 壓力413.7 kPa（60 Psi），輔助加熱氣（GS2，N2） 壓力413.7 kPa（60Psi）。

黃曲霉毒素B1，B2，G1，G2的質譜參數見表2。

表2 黃曲霉毒素B1，B2，G1，G2 的質譜參數

2 結果與分析

2.1 質譜條件的優化

黃曲霉毒素B1，B2，G1，G2在ESI+模式下有較高的響應，通過一級、二級質譜全掃描，選取其中豐度最高的離子作為黃曲霉毒素B1，B2，G1，G2各自的特征離子，調試出最佳的去簇電壓、碰撞室出口電壓、碰撞能量。選取響應最強的離子作為定量離子，響應次之的作為定性離子。

2.2 流動相的優化

在正離子模式下，相比用純水作流動相，加入甲酸更有助于離子化，隨著甲酸濃度的增加，質譜響應值增加，但超過一定的濃度響應反而下降。而乙腈則讓黃曲霉毒素有很高的響應。因此，采用乙腈- 0.1%甲酸水作為流動相，在6 min 內分離效果良好。

黃曲霉毒素B1，B2，G1，G2譜圖見圖1。

圖1 黃曲霉毒素B1，B2，G1，G2 譜圖

2.3 提取劑的優化

針對黃曲霉毒素極性較大的特點，選取了不同比例甲醇水和乙腈水作為提取劑進行比較。發現甲醇∶水（7∶3） 和乙腈∶水（8∶2） 時有較高的回收率，均能達到80%以上，且基質效應影響較小。不同比例溶劑提取液對回收率的影響見表3。

表3 不同比例溶劑提取液對回收率的影響

2.4 凈化劑的優化

QuEChERS 凈化方法比傳統的從樣品提取目標物，更能有效地去除更多的脂肪和顏色，其方法快速、簡便、廉價、有效、耐用、安全。選取的Z-Sep凈化產品，是在凈化管中加入提取液，樣品在提取液和散裝SPE 填料之間進行分配或吸附，從而實現對基質樣品的凈化，能有效消除基質干擾的問題。試驗對比Z-Sep 與C18不同比例下的提取效率，在添加量為20 μg/kg 下進行回收。

不同比例溶劑提取液對回收率的影響見表4。

表4 不同比例溶劑提取液對回收率的影響%

2.5 線性關系及檢出限

用空白基質配置濃度為0.1~10.0 μg/L 的混合標準工作溶液，經液相色譜-質譜上機測試，以目標化合物質量濃度X（μg/L） 為橫坐標，目標化合物對應的峰面積Y 縱坐標，繪制標準曲線，結果顯示在0.1~10.0 μg/L 范圍內線性良好。

回歸方程及檢出限（S/N=3）、定量限（S/N=10）見表5。

表5 回歸方程及檢出限、定量限

2.6 精密度及回收率

稱取樣品，添加0.5，1.0 和5.0 μg/kg 3 水平的黃曲霉毒素標準溶液，按2.3 節的試驗方法進行前處理，計算回收率和標準偏差。

典型樣品的加標回收率和相對標準偏差（n=6）見表6。

表6 典型樣品的加標回收率和相對標準偏差

結果表明，堅果中黃曲霉毒素的回收率為85.9%~112.4%，相對標準偏差（RSD） ≤10%，滿足日常檢測需求。

3 結論

建立了QuEChERS 凈化超高效液相色譜-串聯質譜法測定堅果中的黃曲霉毒素含量的方法。高、中、低不同質量濃度加標回收率85.9%~112.4%，相對偏差（RSD） 在1.02%~5.75%。黃曲霉B1，B2，G1，G2方法定量限為0.5 g/kg。該方法操作簡便、方便快捷、回收穩定，可為堅果中的黃曲霉毒素檢測提供技術支持。