液相色譜-離子阱-飛行時間質譜測定肉制品中8 種可食用著色劑

張 爽，劉敏芳，劉 帆，馬曉艷

（浙江方圓檢測集團股份有限公司，浙江 杭州 310018）

0 引言

可食用著色劑是一類能賦予食品色澤或改善食品色澤的物質，目前我國常用的食品著色劑種類繁多，根據其合成途徑可分為天然著色劑和合成著色劑兩類，按其溶解性質又可分為水溶性和脂溶性著色劑[1]。合成著色劑著色艷麗、價格低廉，被廣泛使用于食品加工行業，然而合成著色劑主要以苯胺染料為原料，經過磺化、鹵化、偶氮化等有機反應合成，對人體具有一定的危害作用，長期攝入可致癌、致畸[2-3]。因此，我國對相關合成著色劑制定了嚴格的管控標準，其中GB 2760—2014 規定靛藍、新紅、亮藍、誘惑紅、檸檬黃、日落黃、胭脂紅、莧菜紅是允許在食品中限量使用的，并明確規定了其最大使用限量[4]。

目前，合成著色劑的檢測方法主要有紫外分光光度法[5]、薄層色譜法[6-7]、毛細管電泳法[8]、高效液相色譜法[9-10]、高效液相色譜串聯質譜法[11-12]。其中，紫外分光光度法在混合著色劑的檢測方面存在互相干擾的問題，薄層色譜法和毛細管電泳法靈敏度低且重現性較差，在合成色素的準確定性和定量方面存在一定局限性。高效液相色譜法能夠有效分離各種合成著色劑，其中GB 5009.141—2016 和GB 5009.35—2016 均采用了高效液相色譜法檢測合成著色劑[13-14]，現行國標GB 5009.35—2016 中只能同時測定7 種合成著色劑，難以滿足市場監管要求。串聯質譜法具有快速、靈敏、高通量和選擇性強等特點，其在分析物精準定性與定量上具有較大優勢，是非常有效的合成著色劑檢測技術。

1 試驗部分

1.1 儀器與試劑

超高效液相色譜-四極桿/靜電場軌道阱高分辨質譜儀，Waters corporation 公司產品；Thermo Scientific 型離心機，賽默飛世爾科技公司產品；旋蒸儀，東京理化器械株式會社產品；GL Sciences WondaSil C18型色譜柱（4.6 mm I.D.×250 mm，5 μm）、甲醇、乙酸銨為色譜純，乙醇、氨水為分析純。

標準物質：靛藍（indigotine，純度99.0%）、新紅（new red，純度92.0%）、亮藍（brilliant blue FCF，純度83.0%）、誘惑紅（allura red AC，純度80.0%）、檸檬黃（tartrazine，純度90.0%）、日落黃（sunset yellow，純度87.0%）、莧菜紅（amaranth，純度81.0%）、胭脂紅（ponceau 4RC，純度75.0%），標準樣品均為壇墨質檢科技股份有限公司提供。

標準溶液的配制：稱取靛藍、新紅、亮藍、誘惑紅、檸檬黃、日落黃、胭脂紅、莧菜紅標準品（精確到0.000 1 g） 配制成1 mg/mL 的標準溶液，備用。根據實際需要配成混標溶液，使用時再將混標溶液稀釋成梯度標準溶液。

1.2 色譜-質譜條件

利用GL Sciences WondaSil C18（4.6 mm I.D.×250 mm，5 μm） 柱進行分離。流動相：A 相，甲醇；B 相，20 mmol/ L 乙酸銨水溶液。柱溫35 ℃，樣品溫度25 ℃，進樣體積5 μL，流速1.0 mL/min。液相色譜流出液分流后進質譜檢測。

梯度洗脫程序見表1。

表1 梯度洗脫程序

離子化模式：電噴霧離子源；霧化氣流速為1.50 L/min；分析模式：負離子模式；干燥氣流速10 L/min；曲形脫溶劑管（CDL） 溫度200 ℃；檢測器電壓1.70 kV；加熱模塊溫度200 ℃；離子源電壓4.5 kV；質譜采集范圍（m/z） 200~600；離子累積時間100 ms。

1.3 樣品預處理

將樣品攪拌均勻制成肉糜后，精確稱取10 g 樣品于50 mL 比色管中，加入乙醇-氨水溶液30 mL，將比色管置于超聲波清洗儀中超聲提取30 min，用乙醇- 氨- 水溶液（7∶2∶1，V/V） 定容至刻度。搖勻，倒入離心管中進行離心（以轉速6 000 r/min 離心10 min），將上清液倒入燒杯中，加熱使乙醇和氨蒸發。待樣液少于10 mL 時，冷卻至溫室。加入檸檬酸溶液，調節pH 值到4.0 左右，再加入聚酰胺，攪均后倒入G3 漏斗中，進行抽濾，分別用pH 值為4.0，溫度為60 ℃的水、甲醇-甲酸（V/V，6∶4）、熱蒸餾水各沖洗3 次，最后再用5 mL 乙醇-氨水-水（7∶2∶1，V/V） 溶液，解析3~5 次。收集全部解析液，用乙酸中和，蒸干，最后用流動相定容到5.0 mL。定容后經0.22 μm 濾膜過濾，濾液進行上機分析。

2 結果與分析

2.1 提取方法選擇

8 種可食用著色劑均為水溶性著色劑，可直接用水進行提取。由于肉制品中脂肪和蛋白含量較高，可用乙醇進行分離，故選用乙醇的水溶液進行提取效果較好，同時再加入部分氨水，會起到更好的提取著色劑的效果，因此試驗選用氨水-乙醇的水溶液來提取樣品。

2.2 方法學驗證

2.2.1 標準曲線與精密度

用超純水配制8 種可食用著色劑的混合標準溶液，然后用流動相將混合標準溶液稀釋成一系列質量濃度，以峰面積和質量濃度繪制標準曲線。

8 種著色劑的保留時間、監測離子、線性回歸方程、線性范圍、相關系數（R2） 及相對標準標準偏差見表2。

表2 8 種著色劑的保留時間、監測離子、線性方程、線性范圍、相關系數及相對標準偏差

2.2.2 檢出限、定量限、回收率的確定

分別在空白樣品中添加3 種不同水平的混合標準溶液，按上述預處理方法進行前處理。

肉制品中8 種可食用著色劑的回收率、檢出限（LOD，S/N=3）、定量限（LOQ，S/N=10） 及相對標準偏差見表3。

表3 肉制品中8 種可食用著色劑的回收率、檢出限、定量限及相對標準偏差

由表3 可知，在低、中、高3 種加標水平，8 種可食用著色劑的回收率分別為50.3%~89.1%，52.6%~103.2%，67.0%~91.6%；相對標準偏差分別為5.6%~9.0%，5.4%~8.9%，5.6%~8.6%，符合日常檢測的要求。

2.3 樣品確證

由于高效液相色譜法存在對目標峰定性不準確的缺點，容易產生誤判。而利用高效液相色譜串聯質譜技術對目標化合物進行定量、定性的方法，造成誤判的可能將大大減小。以日落黃為例。

日落黃的色譜圖見圖1，日落黃的提取離子流圖見圖2。

圖1 日落黃的色譜圖

圖2 日落黃的提取離子流圖

首先，可通過二極管陣列檢測器與離子阱飛行時間質譜的保留時間進行定性。在色譜圖上顯示的日落黃的保留時間為23.4 min，在提取離子流圖上顯示的日落黃的保留時間為23.5 min，保留時間幾乎相同，有細微差別是正常的，這是因為目標物是先經過二極管陣列檢測器進行檢測，然后才進入到質譜被檢測到。所以這樣不會造成錯找目標化合物的色譜峰。其次，可通過精確質量數進行定性。

日落黃的三級質譜圖見圖3。

圖3 日落黃的三級質譜圖

建立了利用液相色譜質譜法測定肉制品中可能濫用的8 種可食用著色劑的分析方法。LCMS-IT-TOF方法的檢出限如下：新紅檢出限0.15 mg/kg，定量限0.5 mg/kg；靛藍、誘惑紅、檸檬黃的檢出限1.50 mg/kg，定量限5.0 mg/kg；亮藍、日落黃檢出限0.75mg/kg，定量2.5 mg/kg；胭脂紅、莧菜紅檢出限0.30 mg/kg，定量限1.0 mg/kg。液相方法的定量限如下：靛藍定量限0.40 mg/kg，亮藍定量限1.04 mg/kg，檸檬黃定量限0.16 mg/kg，莧菜紅定量限0.24 mg/kg，日落黃定量限0.28 mg/kg，胭脂紅和誘惑紅定量限0.32 mg/kg，新紅定量限0.20 mg/kg。8 種可食用著色劑的線性關系較好，相關系數R2＞0.99。相對標準偏差＜10%，3 個水平的加標回收率為50.3%~103.2%，高效液相色譜的加標回收率為70.6%~99.5%。將該方法應用于實際樣品的檢測，并通過離子阱-飛行時間質譜的精確質量數、快速簡便、多級質譜分析、專屬性強、定性準確的優勢對陽性樣品進行了確證，能夠有效地避免假陽性結果的出現，可滿足肉制品中的合成食用色素的分析及確證要求，在食品安全控制中具有很好的實用性。

因此，利用高效液相色譜對目標化合物進行定量，離子阱- 飛行時間質譜進行定性的方法簡便、快速且可同時對陽性樣品進行確證，大大節約了時間及提升了風險監測的能力。

3 結論

建立了利用液相色譜-離子阱-飛行時間質譜法，測定肉制品中可能濫用的8 種可食用著色劑的分析方法，經方法學驗證各指標均滿足日常檢測要求。與現有的檢測標準相比，該方法增加了所檢測的合成著色劑種類。同時，由于利用高效液相色譜對目標化合物進行定量，利用離子阱-飛行時間質譜進行定性，該方法能夠準確快速地對陽性樣品進行確證，大大節約了時間及提升了風險監測的能力。將該方法應用于實際樣品的檢測，能夠有效地避免假陽性結果的出現，可滿足肉制品中的合成食用色素的分析及確證要求，在食品安全控制中具有很好的實用性。