響應面法優化單環刺螠酶解工藝

郭沫然，俞 偉，，賈若冰，劉思萌，劉夢萱，程永強，甘 晶

（1.煙臺大學生命科學學院，山東 煙臺 264000；2.中國農業大學食品營養與工程學院，北京 100083）

0 引言

單環刺螠，俗稱“海腸”，有“裸體海參”的稱號，主要分布于膠東地區，煙臺、青島等地是海腸的主要產區，生長于淺海灘中，肉質鮮美、營養豐富，得到了很多人青睞[1]。單環刺螠體內具有許多特定功能的多肽和多糖、酶等活性物質，如纖溶酶、速激肽、抗菌肽、糖胺聚糖、抗硫化物等，研究表明這些物質對抗菌、抗腫瘤、抗氧化具有積極作用[2]。劉春娥等人[3]發現單環刺螠酶解產物具有抗氧化的功效；初金鑫[4]從單環刺螠中分離出纖溶酶，其具有溶血栓的活性；陳翔[5]通過大鼠試驗證實纖溶酶可以抑制肌酸磷酸激酶和谷草轉氨酶的升高，使血漿凝血酶的時間得以延長；溫春光等人[6]從單環刺螠體內分離出速激肽，這些肽類物質具有消炎和抗癌的功效，單環刺螠因其具有的功能活性肽而深受人們的喜愛，更被開發成高檔調味品。

調味品是一種可以調節食物風味（氣味和滋味）并且可以起到增鮮、解膩、去腥等作用的產品[7]。目前，市場上的調味品主要分為復合調味品（蝦油、雞汁、蠔油等） 和單一呈味調味品（食鹽、味精、白砂糖等）。如今，隨著生活水平的提高，人們不僅注重調味品的風味，更加注重其營養和健康，因此一些具有特定功能的調味品不斷出現。

目前，制備功能活性肽主要是有以下4 種方法，分別為化學水解法、酶解法、化學合成法和微生物發酵法。

趙翊君[8]將鱸魚魚肉用木瓜蛋白進行水解，然后經超濾、凝膠層析分離純化出抗氧化肽；Jiang Xin等人[9]利用枯草芽孢桿菌來發酵玉米麩皮來制備多肽，并且通過小鼠試驗發現這種活性肽具有抗氧化功效。隨著酶解技術的廣泛應用，酶解水產品提取工藝已應用于生產實踐中。

通過單因素試驗及響應面法，以水解度為指標，確定最佳酶的種類、料液比、酶解時間、酶解溫度、pH 值及超聲時間，以期提高其水解度，獲取更多功能多肽，為開發高檔單環刺螠調味品提供理論依據及深加工提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

海腸，購自煙臺萊山區水產市場。

胰蛋白酶，上海如吉生物技術有限公司提供；木瓜蛋白酶、風味蛋白酶、中性蛋白酶、胃蛋白酶，Solarbio 公司提供；甲醛，煙臺健碩化工有限公司提供。

1.2 儀器

電熱鼓風干燥箱，南京第一醫療器械廠產品；超聲波清洗器，濟寧科源儀器有限公司產品；電爐，龍口市電爐制造廠產品；數顯恒溫水浴鍋，國華電器有限公司產品；超低溫冰箱，杭州碩聯電器有限公司產品；超純水系統，萊特萊德有限公司產品；pH 計，上海精密科學儀器有限公司產品；高速冷凍離心機，安徽中科中佳科學儀器有限公司產品；電子天平，梅特勒-托利多精密儀器有限公司產品。

1.3 試驗方法

1.3.1 工藝流程

單環刺螠→去內臟、清洗→冷凍干燥→研磨粉碎→調pH 值→加酶→保溫酶解→離心→上清液→單環刺螠酶解液。

1.3.2 操作要點

將新鮮的海腸去內臟、清洗后放入-80 ℃的冰箱中，將冷凍后的海腸放入冷凍干燥器中，24 h 后拿出冷凍干燥好的海腸，研磨粉碎后溶于適量蒸餾水，對其進行pH 值調節，加入適量蛋白酶，再放入恒溫水浴中進行酶水解。水解完成后，于95 ℃下進行滅酶、冷卻、離心，取上清液。

1.3.3 蛋白酶的選擇

以水解度為指標，在所得最適的條件下用胰蛋白酶、堿性蛋白酶、胃蛋白酶、風味蛋白酶、木瓜蛋白酶分別對海腸體壁肌進行酶解，選擇水解度最高的3 種蛋白酶。

不同蛋白酶的最適酶解參數見表1。

表1 不同蛋白酶的最適酶解參數

1.3.4 單環刺螠的酶解單因素試驗

通過控制加酶量4%，超聲時間50 min，料液比1∶50 不變，探究反應時間、pH 值、反應溫度對酶解液水解度的影響。

（1） pH 值對酶解液水解度的影響。為了探究pH 值對酶解液水解度的影響，選取pH 值7.0，7.5，8.0，8.5，9.0 這5 個梯度進行試驗。

（2） 酶解時間對酶解液水解度的影響。為了探究酶解時間對酶解液水解度的影響，選取1，2，3，4，5 h 這5 個梯度進行試驗。

（3） 酶解溫度對酶解液水解度的影響。為了探究酶解溫度對酶解液水解度的影響，選取45，50，55，60，65 ℃這5 個溫度梯度進行試驗。

1.3.5 響應曲面優化設計試驗

以單因素試驗結果為基礎，采用Box-behnken試驗設計方法，用pH 值、酶解溫度、酶解時間進行三因素三水平響應面試驗，以酶解液的水解度作為指標，探究酶解的最優條件。

響應面試驗因素與水平設計見表2。

表2 響應面試驗因素與水平設計

1.3.6 水解度的測定

用中性甲醛法[10]測定游離氨基酸，用凱氏定氮法[11]測定總氮含量。

水解度按式（1） 計算。

式中：DH——水解度；

C——NaOH 標準溶液的濃度，mol/L；

V——酶解液消耗的NaOH 標準溶液體積，mL；

V0——空白液消耗的NaOH 標準溶液體積，mL；

0.014——1 mL 濃度為1.000 mol/L 的NaOH 標準溶液相當于氮的質量，g；

N——底物樣品的總氮含量，g。

2 結果與分析

3.1 蛋白酶的選擇

水解度，即蛋白質經過酶解后游離氨基酸的量與總氮的比值，反映肽鍵的斷裂程度，是一種可以反映蛋白質水解程度的重要指標。通常情況下，蛋白質的水解程度越大，其水解度就越高。

不同蛋白酶對酶解效果的影響見表3。

表3 不同蛋白酶對酶解效果的影響/ %

由表3 可知，胰蛋白酶的水解度最高，為28.1%，其次為風味蛋白酶和木瓜蛋白酶分別為22.1%，19.4%，水解度最低的是胃蛋白酶。胰蛋白酶[12]水解度最高是因為它屬于肽鏈內切酶，能把多肽鏈中賴氨酸和精氨酸殘基中的羧基側切斷，是特異性最強的蛋白酶。海腸作為一種氨基酸豐富的海產品，精氨酸和賴氨酸的含量較高。因此，其水解度較高。綜合來看，選用水解較高的胰蛋白酶、風味蛋白酶、堿性蛋白酶來進行后續的復合酶解。

3.2 單因素試驗結果

3.2.1 pH 值對酶解液水解度的影響

pH 值對酶解效果的影響見圖1。

圖1 pH 值對酶解效果的影響

為了探究pH 值對酶解液水解度的影響，選取pH 值7.0，7.5，8.0，8.5，9.0 這5 個梯度進行試驗。由圖1 可知，隨著pH 值的升高，水解度呈先升高后降低的趨勢，在pH 值為8.5 時，水解度最高為34.4%。主要是因為隨著pH 值的升高，復合蛋白酶的活性增強，但當pH 值超過8.5 時，其會超過復合酶的最佳pH 值范圍，因此水解度會下降[13]。

3.2.2 酶解時間對酶解液水解度的影響

為了探究酶解時間對酶解液水解度的影響，選取1，2，3，4，5 h 這5 個梯度進行試驗。由圖2 可知，隨著酶解時間的延長，水解度逐漸增加，之后趨于平穩。主要是因為酶解時間越長，蛋白質被水解得越充分，在酶解時間到達3 h 后，水解度趨于平緩，主要是隨著反應的進行，底物在不斷減少，水解速率也會下降。

圖2 酶解時間對酶解效果的影響

酶解時間對酶解效果的影響見圖2。

3.2.3 酶解溫度對酶解效果的影響

酶解溫度對酶解效果的影響見圖3。

圖3 酶解溫度對酶解效果的影響

為了探討酶解溫度對酶解液水解度的影響，選擇了45，50，55，60，65 ℃這5 個溫度梯度進行試驗。由圖3 可知，隨著溫度的升高，水解度先升高后降低。當溫度為50℃時，最大水解度為30.2%。這主要是因為復合蛋白酶的活性隨著溫度的升高而增加，但當溫度超過55 ℃時，會導致蛋白酶變性，因此水解程度會降低[14]。

3.3 響應曲面優化試驗結果分析

根據單因素試驗結果，根據上述試驗因素和水平，以水解度作為響應值，采用Design Expert 8.0 軟件進行三因素三水平的Box-behnken 試驗設計。

響應面設計方案及結果見表4。

表4 響應面設計方案及結果

用Design Expert 12 對響應面結果進行二次多元回歸擬合[15]，得到酶解pH 值（A）、酶解溫度（B）、酶解時間（C） 的二次多項回歸方程：

DH=34.06+0.662 5A+0.475 0B+0.637 5C-0.375 0AB+0.000 0AC-0.225 0BC-1.88A2-1.96B2-1.88C2.

方差分析見表5。

表5 方差分析

由表5 可知，模型具有p＜0.000 1，不匹配不顯著（p=0.234 3＞0.05），表明模型顯著，所選二次模型是合適的。模型的R2=0.988 3，R2Adj=0.973 4 表明，該模型擬合度好，試驗誤差小，適合于分析和預測海腸的水解度。此外，因素A、B、C、A2、B2和C2對結果有顯著影響（p＜0.01），而因素AB、AC 和BC對結果沒有顯著影響（p＞0.05）。根據因子分析，3 個反應條件對水解度的影響依次為pH 值＞酶解時間＞酶解溫度。

響應面分析圖和等高線圖見圖4。

圖4 響應面分析圖和等高線圖

由圖4 可知，AB、AC 和BC 的等高線圖大致呈圓形，表明酶解溫度、酶解時間和pH 值之間的相互作用不顯著。AB 三維圖是固定酶解時間，即3 h。基于此，可以得出結論，當酶解時間固定時，pH 值軸上的響應值比酶解溫度軸上的響應值更陡，這表明pH 值對水解度的影響大于酶解溫度。AC 立體圖是將酶解溫度固定為50 ℃。由此可以得出結論，當酶解溫度恒定時，pH 值軸上的響應值比酶解時間軸上的響應值陡峭，這表明pH 值對水解程度的影響大于酶解時間。BC 三維圖確定酶解pH 值為7。基于此，可以得出結論，當酶解pH 值恒定時，酶解時間軸上的響應值比酶解溫度軸上的響應值更陡，這表明酶解時間對水解度的影響大于酶解溫度。可以看出，該結論與方差分析的結論是一致的。此外，根據AB 的三維圖，水解度隨著pH 值和酶解溫度的升高而增加，但在達到峰值時逐漸減弱。AC 的三維圖與BC 的三維圖大致相同，這可以通過相同的原因獲得。

根據對響應面的結果進行二次多元回歸擬合所得響應面擬合方程進行參數最優分析，最終預測得到最佳工藝條件為pH 值8.58，酶解時間3.16，酶解溫度50.48。為了便于操作，酶解時間設為3 h，酶解溫度設為50 ℃，pH 值設為8.5，在此條件下進行3 組平行試驗，水解度的實際測得值為34.4%，與模型的預測值34.19%接近，相對誤差為1.33%。

3 結論

以海腸為原材料研究其酶解的最佳工藝，在單因素試驗的基礎上，采用響應面法建立了海腸酶解工藝的二次多項式數學模型，對酶解條件進行了優化。通過分析酶解pH 值、酶解溫度、酶解時間三因素交互作用對酶解海腸水解度的影響，得到最佳酶解時間3.16 h，pH 值8.58，酶解溫度50.48 ℃，此時的水解度DH 值34.19%。該研究可獲取更多功能多肽，為開發高檔單環刺螠調味品提供理論依據及深加工提供參考。