微小RNA-105-5p靶向白細胞介素6受體調控卵巢癌細胞增殖和轉移臨床研究

劉麗霞,王 釗

(大連市中醫醫院婦科, 遼寧 大連 116001)

卵巢癌是女性常見的致死性惡性腫瘤,由于疾病早期診斷困難,大多數患者被診斷為晚期,甚至發生腹膜或遠端器官轉移,給疾病治療帶來巨大困難[1-3]。近年來分子靶向治療和基因治療已成為腫瘤治療的新趨勢,研究卵巢癌發生、轉移的分子機制有助于開發新的卵巢癌治療靶點。微小RNA(microRNA,miRNA)是重要的非編碼RNA,其通過在轉錄后或翻譯水平負調控基因表達參與許多細胞過程的調控。miRNA表達失調與腫瘤細胞的異常增殖以及惡性侵襲等生物學行為有關,是癌癥進展的促進或抑制因子[4-5]。微小RNA-105-5p(microRNA-105-5p,miR-105-5p)在肝癌干細胞中表達降低,可促進肝癌干細胞生長[6]。早期研究指出卵巢癌中miR-105-5p表達下調[7],但miR-105-5p是否參與卵巢癌細胞增殖和轉移仍然未知。白細胞介素6(Interleukin 6,IL-6)是卵巢癌免疫微環境中存在的免疫調節細胞因子[8]。IL-6R在卵巢癌組織、細胞中表達增加,下調IL-6R表達顯著降低卵巢癌細胞體外增殖、侵襲能力以及體內致瘤性[9]。本研究通過生物信息學發現IL-6R是miR-105-5p潛在靶點,于是推測miR-105-5p可能靶向調控IL-6R參與卵巢癌進展。本研究重點分析了miR-105-5p和IL-6R在卵巢癌組織中表達水平,揭示了miR-105-5p和IL-6R表達對卵巢癌細胞增殖、遷移和侵襲的影響,闡明了miR-105-5p對IL-6R的靶向調控作用,現報告如下。

1 材料與方法

1.1 組織來源 選取2017—2018年在我院確診進行手術治療的30例卵巢癌組織和對應的癌旁組織標本。癌旁組織為距離腫瘤邊緣大于2 cm處正常卵巢組織。所有組織樣本切除后立即置于液氮中,后保存于-80 ℃冰箱中。病例納入標準:術后病理診斷確診為卵巢癌。排除標準:術前接受抗腫瘤治療。研究開展之前已獲得我院倫理委員會批準,且所有患者或其家屬均知情同意。

1.2 細胞和試劑 SKOV-3購于中科院上海細胞庫;miRNA逆轉錄試劑盒、miRNA分析試劑盒購于美國ABI公司;逆轉錄酶、SYBR Green Master mix購于日本takara公司;熒光素酶報告載體、miR-576-3p模擬物(mimics)及其陰性對照(miR-NC mimics)、IL-6R小干擾RNA(si-IL-6R)及其陰性對照(si-NC)、IL-6R過表達載體(pcDNA-IL-6R)及其陰性對照(pcDNA-NC)購于廣州復能基因公司;細胞計數試劑盒(CCK-8)購于北京索萊寶公司;Transwell和Transwell小室購于北京優尼康公司;羊抗兔IgG二抗以及兔抗人、IL-6R、磷酸甘油醛脫氫酶(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)、增殖標記蛋白細胞增殖核抗原-67(Antigen identified by monoclonal antibody,Ki-67)、基質金屬蛋白酶-2(Matrix metalloproteinases-2,MMP-2)、基質金屬蛋白酶-9(Matrix metalloproteinases-9,MMP-9)單克隆抗體購于上海艾博抗公司。

1.3 實時定量PCR(RT-qPCR)檢測miR-105-5p和IL-6R表達 TRIzol試劑提取卵巢癌組織中總RNA,純化后利用miRNA逆轉錄試劑盒、miRNA分析試劑盒檢測miR-105-5p表達。利用逆轉錄酶、SYBR Green Master Mix檢測IL-6R mRNA表達水平。miR-105-5p上游引物5’-UCAAAUGCUCAGACUCCUGUGGU-3’,下游引物5’-CATCCTCGATGGTCTCCTGC-3’;U6上游引物5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’,下游引物5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’;IL-6R上游引物5’-TCACTGTGTCATCCACGAC G-3’,下游引物5’-AGCCAGCTATCTGGGGAAGA-3’;GAPDH上游引物5’-GACCTGACCTG CCGTCTA-3’,下游引物5’-GGAGTGGGTGTCGCTGT-3’。

1.4 細胞培養、實驗分組和細胞活力檢測 用含1%青霉素/鏈霉素、10%胎牛血清的RPMI-1640培養基培養SKOV-3細胞。將對數期SKOV-3細胞接種6孔板,利用Lipofectamine 2000將miR-NC mimics、miR-105-5p mimics、si-NC、si-IL-6R、miR-576-3p mimics與pcDNA-NC、miR-576-3p mimics與pcDNA-IL-6R分別轉染融合率為50%的SKOV-3細胞,分別標記為miR-NC mimics組、miR-105-5p mimics組、si-NC組、si-IL-6R組、miR-576-3p mimics+pcDNA-NC組、miR-576-3p mimics+pcDNA-IL-6R組,轉染48 h采用RT-qPCR和蛋白質印跡法(WB)檢測轉染效果,合格后進行后續實驗。將轉染細胞按照3×104個/ml、0.1 ml/孔轉移至96孔板,培養箱孵育48 h時添加按10 μl/孔添加CCK-8溶液。再孵育2 h后,酶標儀測量450 nm的各孔光密度(OD)值。

1.5 Transwell實驗檢測細胞遷移和侵襲 使用無血清細胞培養基將各組細胞制成3×104個/ml的細胞懸液。取200 μl細胞懸浮液加至預先涂有(侵襲)或未涂(遷移)基質膠Transwell上腔室中,同時將下腔室中加入500 μl含10%血清的細胞培養基。培養箱孵育24 h后,除去膜上未穿膜細胞,甲醇固定膜下表面細胞后進行結晶紫染色。顯微鏡下計數5個隨機視野細胞數,采用其均值表示細胞遷移或侵襲細胞數。

1.6 蛋白質印跡法(WB)分析IL-6R、Ki-67以及MMP-2和MMP-9蛋白表達 冰上裂解各組細胞并收集上清液,二辛可寧酸法測定蛋白質濃度。聚丙烯酰胺凝膠電泳分離細胞蛋白后轉移到硝酸纖維素膜,并在室溫下用脫脂牛奶封閉膜2 h,再與1∶1500稀釋的抗IL-6R、Ki-67、MMP-2、MMP-9抗體在4 ℃下過夜,最后與二抗孵育2 h。增強型化學發光試劑檢測蛋白條帶,Image J軟件測定各條帶灰度值,以目的蛋白和內參灰度值比值表示對應蛋白相對表達量。

1.7 雙熒光素酶報告基因實驗 生物信息學軟件在線分析顯示miR-105-5p和IL-6R-3’-UTR存在互補序列。將含有miR-105-5p結合位點的IL-6R-3’UTR序列插入pGL3載體下游構建野生型熒光素酶報告載體WT-IL-6R-3’UTR。通過突變miR-105-5p的預測結合位點,構建野生型熒光素酶報告載體MUT-IL-6R-3’UTR。脂質體轉染法將WT-IL-6R-3’UTR或MUT-IL-6R-3’UTR分別與miR-105-5p mimics或miR-NC共轉染SKOV-3細胞,雙熒光素酶報告基因檢測系統檢測轉染48 h后熒光素酶活性。

2 結 果

2.1 卵巢癌組織中miR-105-5p和IL-6R表達情況 卵巢癌組織中miR-105-5p表達量較癌旁組織顯著降低(P<0.05),而IL-6R表達量較癌旁組織顯著升高(P<0.05)。見表1。

表1 卵巢癌組織中miR-105-5p和IL-6R表達情況

2.2 miR-105-5p過表達對細胞增殖、遷移和侵襲的影響 miR-105-5p mimics組SKOV-3細胞miR-105-5p表達量較miR-NC mimics組顯著升高(P<0.05),而細胞活力、遷移和侵襲細胞數、IL-6R、Ki-67以及MMP-2和MMP-9表達量顯著降低,差異有統計學意義(均P<0.05)。見表2。

表2 miR-105-5p過表達對細胞增殖、遷移和侵襲的影響

2.3 miR-105-5p靶向調控IL-6R的表達 生物信息學軟件預測miR-105-5p的靶基因發現miR-105-5p與IL-6R-3’UTR之間存在特異性互補序列,見圖1。WT-IL-6R-3’UTR和miR-105-5p mimics共轉染后SKOV-3細胞相對熒光素酶活性較WT-IL-6R-3’UTR和miR-NC共轉染顯著降低;而MUT-IL-6R-3’UTR和miR-105-5p mimics共轉染后SKOV-3細胞相對熒光素酶活性較MUT-IL-6R-3’UTR和miR-NC共轉染無顯著變化,見表3。

圖1 IL-6R的序列中含有與miR-105-5p互補的核苷酸序列

表3 雙熒光素酶報告實驗

2.4 抑制IL-6R表達對細胞增殖、遷移和侵襲的影響 si-IL-6R組SKOV-3細胞IL-6R表達量、細胞活力、遷移和侵襲細胞數、Ki-67以及MMP-2和MMP-9表達量較si-NC組顯著降低,差異有統計學意義(均P<0.05)。見表4。

表4 抑制IL-6R表達對細胞增殖、遷移和侵襲的影響

2.5 過表達IL-6R可逆轉miR-105-5p過表達對細胞增殖、遷移和侵襲的影響 miR-576-3p mimics+pcDNA-IL-6R組SKOV-3細胞IL-6R表達量、細胞活力、遷移和侵襲細胞數、Ki-67以及MMP-2和MMP-9表達量較miR-576-3p mimics +pcDNA-NC組顯著升高,差異有統計學意義(均P<0.05)。見表5。

表5 過表達IL-6R可逆轉miR-105-5p過表達對細胞增殖、遷移和侵襲的影響

3 討 論

幾十年來,已經鑒定出多種miRNA在卵巢癌發生和進展中起關鍵作用。例如miR-126-3p低表達參與卵巢癌細胞增殖和侵襲[10]。miR-148a-3p低表達卵巢癌異種移植瘤小鼠體內腫瘤形成[11]。上調控miR-378a-3p表達可提高卵巢癌細胞的順鉑敏感性[12]。本研究檢測到卵巢癌組織中miR-105-5p表達量顯著降低,這提示miR-105-5p異常低表達可能參與卵巢癌進展。功能分析發現,過表達miR-105-5p可抑制SKOV-3細胞增殖、遷移和侵襲,表明miR-105-5p在卵巢癌中起著抑癌作用。與本研究發現類似,在膠質瘤中過表達miR-105-5p抑制膠質瘤細胞生長、集落形成和遷移,抑制膠質瘤進展,進一步證實miR-105-5p的抑癌作用[13]。為探討miR-105-5p的抗癌機制,本研究檢測細胞增殖相關蛋白以及遷移侵襲相關蛋白表達水平。Ki-67與細胞有絲分裂密切相關,Ki-67水平越高,細胞增殖越活躍,組織分化越差[14]。在腫瘤細胞侵襲轉移中MMP家族蛋白具有重要功能,尤其是MMP-2、MMP-9,其可降解細胞外基質中各種組分,其表達增加可增強癌細胞遷移和侵襲能力[15-16]。本研究發現過表達miR-105-5p導致Ki-67、MMP-2、MMP-9蛋白表達增加,這提示過表達miR-105-5p可通過影響增殖、遷移侵襲相關蛋白表達進而降低卵巢癌細胞增殖、遷移和侵襲能力。

IL-6R在人類癌癥中表達上調并發揮致癌作用,且IL-6R表達受miRNA調控。研究報道miR-218靶向IL-6R抑制肺癌細胞的增殖、侵襲和腫瘤形成[17]。在費城染色體陽性急性淋巴細胞白血病中miR-451a表達降低,其重新表達通過IL-6R抑制白血病細胞增殖、誘導細胞凋亡[18]。miR-451通過靶向IL-6R-STAT3途徑還可抑制肝癌血管生成[19]。此外,有研究指出在卵巢癌中miR-204的順鉑增敏作用亦與靶向負調控IL-6R有關[20]。本研究中發現卵巢癌組織中IL-6R表達顯著增加。進一步研究證實IL-6R是miR-105-5p的直接靶點,過表達miR-105-5p顯著降低卵巢癌細胞中IL-6R表達水平,提示miR-105-5p可能靶向IL-6R參與卵巢癌進展。通過功能缺失實驗分析IL-6R對卵巢癌細胞生物學行為影響顯示,干擾IL-6R表達顯著降低SKOV-3細胞活力以及遷移侵襲能力,并降低Ki-67以及MMP-2、MMP-9蛋白表達水平,這表明IL-6R在卵巢癌中具有致癌功能。過表達miR-105-5p和干擾IL-6R表達的抗癌作用一致,且過表達IL-6R顯著減弱miR-105-5p過表達對SKOV-3細胞增殖、遷移以及相關蛋白表達的影響,恢復SKOV-3細胞的增殖、遷移和侵襲能力,這進一步證實靶向負調控IL-6R是miR-105-5p抑制卵巢癌進展的重要途徑。

綜上所述,卵巢癌中miR-105-5p表達下調,過表達miR-105-5p通過靶向下調IL-6R可抑制卵巢癌細胞增殖和轉移,這豐富了卵巢癌進展的分子機制,為卵巢癌治療提供了潛在靶點。