外周血單核細胞Toll樣受體/核轉錄因子-κB信號通路分子表達水平與血液透析合并血液感染患者病情嚴重程度相關性分析

王 浩,高春美

(淄博一四八醫院急診科,山東 淄博 255300)

血流感染(Bloodstream infection,BSI)指病原菌在血液循環中繁殖并釋放毒素和代謝產物造成的全身性炎癥反應綜合征,可快速引起膿毒性休克(Septic shock,SS)并威脅患者生命安全,文獻報道每延遲6 h,生存率可下降7%以上[1-3]。血液透析(Hemodialysis,HD)是治療急慢性腎功能衰竭常用手段,有利于快速清除體內蓄積的代謝產物并進行物質交換,從而達到維持電解質和酸堿平衡的作用[4]。導管相關性感染(Catheter related bloodstream infection,CRBSI)是HD治療常見并發癥,羅杏英等[5]報道顯示發病率達11.45%,是影響患者預后的重要危險因素,因此明確CRBSI發病和進展相關機制具有重要臨床意義。近年來對炎癥信號通路在膿毒癥中作用的認識已逐漸明確,病變早期與促炎因子引起的“炎癥風暴”密切相關,病變晚期則表現為抗炎因子可大量表達并造成免疫抑制,為疾病不同階段采用合理干預方案提供參考[6]。既往研究表明Toll樣受體(Toll-like receptors,TLRs)是模式識別受體(Pattern recognition receptors,PRRs)中最早被發現并進行深入研究的一種,在調節機體免疫應答和炎癥反應中發揮重要作用,其中TLR4接受細菌或病毒等抗原刺激后可通過髓樣分化因子88(Myeioid differentiation factor88,MyD88),依賴途徑激活下游核因子κB(Nuclear factor κB,NF-κB)信號通路并參與調控白介素(Interleukin,IL)和腫瘤壞死因子-α(Tumor necrosis factor α,TNF-α)等炎癥介質轉錄,從而造成炎癥反應級聯放大[7-9]。本研究主要分析外周血單核細胞TLR4/NF-κB信號通路激活與HD合并CRBSI患者病情嚴重程度的關系,報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2020年1月至2022年12月間淄博一四八醫院HD治療期間出現的82例CRBSI患者(CRBSI組)為樣本進行橫斷面研究,病例納入標準:①符合CRBSI相關診斷標準[10];②均經病原學檢查證實;③接受規律HD治療且每周≥2次;④年齡≥18歲;⑤患者和家屬知曉本研究內容并簽署同意書。排除標準:①合并乙肝、艾滋病病毒(HIV)及結核等傳染病或病史;②合并其他類型感染性疾病;③免疫抑制劑或激素類藥物長期應用史;④合并惡性腫瘤或放化療史;⑤合并1個月內手術或外傷病史;⑥合并精神疾病或認知障礙。同時另選取我院同期未發生CRBSI的HD患者83例(HD組),納入標準包括年齡≥18歲、規律HD治療且頻率為每周≥2次以及患者和家屬知情同意,排除標準全部同CRBSI組,本研究內容符合《赫爾辛基宣言》原則。

1.2 研究方法

1.2.1 資料采集和分析:收集三組性別、年齡、既往史、基礎疾病及合并癥等基本資料,測量身高、體重和血壓等指標并計算體重指數(Body Mass Index,BMI),采用急性生理學與慢性健康狀況評分Ⅱ(Acute Physiology and Chronic Health EvaluationⅡ,APACHEⅡ)評估感染嚴重程度,同時采集三組入組第1天空腹外周靜脈血5 ml×3管保存備用,分別檢測外周血單核細胞TLR4和NF-κB表達水平以及血清IL-4、IL-6和TNF-α水平,根據分級診斷標準將HD合并CRBSI患者分為休克組23例和非休克組59例并按指南進行治療[11],同時隨訪28 d病死率。

1.2.2 外周血單核細胞TLR4檢測:將血液樣本在4 ℃環境以1500 r/min離心15 min,去除上清液后采用Coulter Epics XL型流式細胞儀(美國Beckman公司)分離單核細胞,加入2倍體積培養液并以6000 r/min離心5 min,將沉淀層細胞加入全培養液中并治愈含50% CO2的培養箱中溫育24 h,然后在15 ℃環境以1000 r/min離心5 min,去除上清液并加入帶PE標記的兔抗人TLR4單克隆抗體和二抗(英國Abcam公司),避光冰浴60 min后采用NanoDrop ND-1000型紫外分光光度計(美國Thermo Scientific公司)測量TLR4熒光強度值,以β-actin光密度值為對照計算TLR4相對表達量。

1.2.3 外周血單核細胞NF-κB檢測:將血液樣本5 ml與D-Hank’s液5 ml充分混勻后以1500 r/min離心15 min,吸取第1、3層之間的白色細胞并置于5 ml D-Hank’s液中,充分搖勻并以2000 r/min離心15 min,去除上清液后以PBS緩沖液洗滌2次,再采用全培養液重懸24 h,PBS緩沖液洗滌1次,靜置25 min后加入10% NP-40并渦動10 s,室溫條件下以15000 r/min離心30 s后去除上清液,再與Buffer C冷緩沖液充分混勻并進行冰浴,其間連續攪拌40 min,然后在4 ℃條件下以16000 r/min離心10 min,取上清加入NF-κB單抗和(英國Abcam公司)并測量NF-κB熒光強度并以β-actin光密度值為對照計算NF-κB相對表達量。

1.2.4 炎癥因子檢測:將血液樣本5 ml在4 ℃環境以3000 r/min離心15 min并取上清-20 ℃保存,采用酶聯免疫吸附法(Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)檢測IL-4、IL-6和TNF-α水平,試劑盒均有上海基康生物技術有限公司生產,所有操作步驟均嚴格遵循說明書要求完成。

2 結 果

2.1 兩組一般資料比較 CRBSI組APACHEⅡ評分明顯高于HD組(P<0.05),兩組性別、年齡、BMI、透析齡、煙酒史、基礎疾病及合并癥等比較差異無統計學意義(均P>0.05),見表1。

表1 兩組一般資料比較

2.2 兩組TLR4/NF-κB信號通路激活情況比較 CRBSI組外周血單核細胞TLR4和NF-κB表達水平以及血清IL-4、IL-6和TNF-α水平高于HD組,差異有統計學意義(均P<0.05),見表2。

表2 兩組TLR4/NF-κB信號通路激活情況比較

2.3 不同嚴重程度HB合并CRBSI患者TLR4/NF-κB信號通路激活情況比較 休克組HB合并CRBSI患者外周血單核細胞TLR4和NF-κB表達水平以及血清IL-4、IL-6和TNF-α水平高于非休克組,差異有統計學意義(均P<0.05),見表3。

表3 不同嚴重程度HB合并CRBSI患者TLR4/NF-κB信號通路激活情況比較

2.4 不同預后HB合并CRBSI患者TLR4/NF-κB信號通路激活情況比較 隨訪結果顯示CRBSI組28 d病死患者數量為17例(20.73%),病死組HB合并CRBSI患者外周血單核細胞TLR4和NF-κB表達水平以及血清IL-4、IL-6和TNF-α水平高于存活組,差異有統計學意義(均P<0.05),見表4。

表4 不同預后HB合并CRBSI患者TLR4/NF-κB信號通路激活情況比較

2.5 TLR4/NF-κB信號通路與HD合并CRBSI感染嚴重程度的關系 HB合并CRBSI患者外周血單核細胞TLR4和NF-κB表達水平以及血清IL-4、IL-6和TNF-α水平均與APACHEⅡ評分呈明顯正相關性(P<0.05),見表5。

表5 TLR4/NF-κB信號通路與HD合并CRBSI感染嚴重程度的關系

3 討 論

近年來由于人口老齡化、抗生素濫用和侵入性操作等因素影響,CRBSI發病率和嚴重程度明顯增加,美國學者開展的回顧性隊列研究顯示住院患者菌血癥發生率和病死率分別為5.9%和15.6%[12-13]。國內一項對湖北省47所醫院ICU醫院感染連續4年的監測結果顯示CRBSI發病率為1.45‰[14]。雖然近年來國內外對CRBSI重視程度明顯增加,但發病率目前仍然較高且患者預后不理想,原因可能與其詳細發病機制尚未完全明確有關。

HD患者因腎功能損害和免疫功能減退,導致體內炎癥因子表達水平異常并不斷蓄積,因此透析過程中常處于慢性炎癥狀態,CRBSI發生率受創傷或雜質等因素影響明顯升高[15]。既往研究表明CRBSI主要危險因素包括年齡、營養水平、血管通路以及透析時間等,感染發生后可快速進展為膿毒癥甚至休克[16]。文獻報道膿毒癥為系統性炎癥反應綜合征(SIRS)和代償性抗炎反應(CARS)共同作用所致,感染早期促炎反應占明顯優勢,患者表現為高熱、高代謝以及休克,該過程與細菌內毒素、肽聚糖或脂蛋白等抗原激活單核巨噬細胞或其他淋巴細胞表面TLRs/NF-κB信號通路并誘導大量炎癥因子表達關系密切[17-19]。TLR4為高度保守性的Ⅰ型跨膜蛋白,是目前認識最為全面的人體PRRs,廣泛分布于淋巴細胞、巨噬細胞及自然殺傷細胞(NK)細胞等胞膜表面,在固有免疫和特異性免疫反應中均占有重要地位[20]。NF-κB為Rel/NF-κB家族成員轉錄產物,正常情況下與特異性抑制蛋白(IKB)結合為無活性三聚體,在胞外信號刺激下發生磷酸化并向細胞核遷移,從而誘導炎癥因子表達[21]。本研究結果顯示與單純HD患者相比,合并CRBSI的患者外周血單核細胞TLR4和NF-κB表達水平明顯升高,提示CRBSI發生與TLR4/NF-κB信號通路激活存在密切聯系,與關亞男等[22]報道結果相一致。同時本研究結果顯示休克組和病死組患者外周血單核細胞TLR4和NF-κB表達水平較非休克組和存活組均明顯升高,可見HD合并CRBSI患者病情嚴重程度還與TLR4/NF-κB信號通路關系密切。APACHEⅡ評分是評估重癥患者病情和預后常用方法,本研究Pearson積差系數分析顯示HD合并CRBSI患者外周血單核細胞TLR4和NF-κB表達水平與APACHEⅡ評分呈明顯正相關性,可見TLR4/NF-κB信號通路在CRBSI病情進展過程中發揮重要作用。

炎癥反應是膿毒癥發生和進展關鍵環節,張婭琴等[23]以98例膿毒癥患者為樣本進行研究表明降鈣素原(PCT)和C反應蛋白(CRP)等炎性指標對評估病情嚴重程度和預后具有重要參考價值。本研究中CRBSI組血清IL-4、IL-6和TNF-α水平明顯高于HD組,其中IL-4為抗炎因子,IL-6和TNF-α為促炎因子,表明HD合并CRBSI感染患者體內同時促炎反應和抗炎反應,兩者平衡破壞是導致病情進展和預后不良的重要機制。文獻報道膿毒癥患者早期通常表現為過度炎癥反應,后期抗炎因子代償性表達增加可抑制促炎因子表達并導致機體長期處于免疫抑制階段,容易繼發其他感染并造成不良后果,因此臨床治療方案需根據疾病階段進行合理選擇,血清IL-4、IL-6和TNF-α等炎癥因子表達水平是重要參考依據[24]。本研究中休克組和病死組HD合并CRBSI患者血清IL-4、IL-6和TNF-α表達水平明顯升高,且Pearson積差分析顯示與APACHEⅡ評分呈明顯正相關性,表明炎癥因子與病情輕重密切相關。Li等[25]報道顯示TLR4/NF-κB信號通路可刺激大量炎癥因子釋放,誘導巨噬細胞和中性粒細胞聚集,是炎癥級聯反應的重要基礎,可見TLR4/NF-κB信號通路在誘導炎癥因子表達中發揮重要作用,與HD合并CRBSI病情嚴重程度存在密切聯系。

綜上所述,TLR4/NF-κB信號通路激活和炎癥因子大量表達與HD合并CRBSI患者發病和進展存在密切聯系,對評估病情嚴重程度和合理選擇治療方案具有良好參考價值。