CircRNA-0003340 在2 型糖尿病大鼠肝臟組織中的表達及意義

楊紅紅 巴 濤 倪 凡 朱余蓉 常向云

石河子大學醫學院第一附屬醫院內分泌代謝科 （石河子 832000）

糖尿?。╠iabetes mellitus，DM）是一種危害人類健康的代謝性疾病，由IDF統計全球約有4.63億人次患有糖尿?。欢覈?型糖尿?。╰ype 2 diabetes millitus，T2DM）在糖尿病人群中的占比90%以上［1-2］。T2DM長期不僅累及腦、心、眼、腎等多器官的病變，而且還與多種腫瘤的發生、發展密切相關，嚴重威脅人們的生存及生活質量［3-4］。肝臟是葡萄糖和脂類合成、代謝、儲存及再分配的核心器官，是胰島素作用的主要靶組織，同時肝臟組織還會分泌一系列的肝激素及脂肪因子來參與血糖、血脂的調節［5］。而在T2DM中，由于高糖狀態使肝臟組織中糖代謝的中心樞紐6-磷酸葡萄糖下游的代謝途徑增加，引起肝臟合成的甘油三酯增加、異位脂質在肝臟中堆積，導致肝臟脂肪變性，加速胰島素抵抗（insulin resistance，IR）［6-7］。環狀RNA（circRNA）是一種不被核酸外切酶降解的特殊類型的閉環結構的非編碼RNA，通過海綿作用吸附miRNA，影響靶基因的表達參與多種疾病的發生發展、發展［8］。尤其是在糖尿病這一領域，已有多項研究［9-10］表明circRNA參與其中。Hsa-circRNA-0003340是位于人體第7號染色體（chr7）：44684925-44687358（ http：//www.circbank.cn/search.html），基因同源性分析顯示，該circRNA也存在大鼠體內，位于大鼠第14號染色體chr：86434307|86438230，由OGDH基因反剪產生。肝臟作為胰島素的主要靶組織，參與血糖調節，circRNA在T2DM肝臟組織中的表達鮮有研究。因此本研究擬通過觀察circRNA-0003340在T2DM大鼠模型肝臟組織中的表達情況，探討circRNA與T2DM的關系，為深入研究circRNA在T2DM的發生發展過程中的調控功能提供理論基礎及實驗依據，為T2DM的診治開拓新的研究方向。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及主要試劑和儀器

無特定病原體（SPF）級雄性SD大鼠30只（n=30），5周齡，體質量約（200±20）g，購于新疆醫科大學動物實驗中心。鏈脲佐菌素（Streptozotincin，STZ）購于美國Sigma公司，血糖測試儀購于羅氏公司，ELISA試劑盒購自武漢云克隆科技有限公司。cDNA反轉錄試劑盒、PCR試劑盒均購于日本TAKARA公司，Trizol試劑購于美國Invitrogen公司，引物購自上海生工。蘇木紅素、伊紅染液均購自武漢塞維爾生物。

1.2 動物模型的建立與分組

將SD大鼠適應性飼養1周，隨機分為正常對照（normal control，NC）組10只與造模組20只。造模組高脂高糖飼料飼養4周，于第4周末禁食12 h，按30 mg/kg給予一次性腹腔注射1%STZ，72小時后尾靜脈采血測血糖，以空腹血糖（fasting plasma glucose，FPG）≥11.1 mmol/L或隨機血糖≥16.7 mmol/L作為T2DM造模成功的標準。2型糖尿病模型建立成功后繼續高脂高糖飼料再喂養到8周［11］。8周后隨機分為正常對照組與造模組各6只大鼠進行后續研究。

1.3 腹腔糖耐量實試驗及胰島素耐量試驗

建模成功后的第4周，對2組SD大鼠隔夜禁食12 h后行腹腔糖耐量（introperitoneal glucose tolerance test，IPGTT）試驗，依次腹腔注射20%葡萄糖（2 g/kg），分別于0、15、30、60、90、120 min使用羅氏血糖儀測大鼠尾靜脈血糖并記錄實驗數據。隔日對2組SD大鼠行腹腔胰島素耐量（introperitoneal insulin tolerance test，IPITT）實驗，每組禁食6 h，依次腹腔注射胰島素注射液（0.75 U/kg），分別于0、15、30、60、90、120 min使用羅氏血糖儀測大鼠尾靜脈血糖并記錄實驗數據。

1.4 各組生化指標的測定

造模成功第6周末，取尾靜脈血用羅氏血糖儀測血糖；處死SD大鼠，取頸靜脈血3 mL，3 000 r離心取上清液，酶聯免疫吸附法（ELISA法）測定SD大鼠的空腹血清胰島素（fasting insulin，FINS）、糖化血紅蛋白（glycated hemoglobin，HbA1c）。全自動生化儀測血清FPG、總膽固醇（total cholesterol，TC）、甘油三酯（triglyceride，TG）、高密度脂蛋白膽固醇（high-density lipoprotein cholesterol，HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C）、天冬氨酸轉氨酶（aspartate aminotransferase，AST）、丙氨酸轉氨酶（alanine aminotransferase，ALT）。計算胰島素抵抗指數（homeostasis model assessment of insulin resistance，HOMA-IR）=FINS×FPG/22.5。

1.5 HE染色

將胰腺組織標本置于4 ℃的10%的福爾馬林溶液中固定，石蠟包埋處理。將石蠟切片依次置入二甲苯、無水乙醇、75%酒精脫蠟，用塞維爾蘇木素染液染色3～5 min，自來水沖洗；塞維爾生物蘇木素反藍液進行反藍，自來水沖洗，置入85%、95%的酒精分別脫水5 min；伊紅染色5 min，用無水乙醇、二甲苯進行脫水透明，封片。每張切片隨機選取3個高倍鏡視野（×100），觀察比較2組SD大鼠胰島細胞的形態。經具有豐富的臨床經驗的3位病理科醫師復審切片，確保真實性及準確性。

1.6 RT-PCR檢測大鼠肝臟組織circRNA-0003340的表達

麻醉處死SD大鼠后立即打開腹腔，無菌環境下分離新鮮的肝臟組織，置于無菌袋中凍存于-80 ℃冰箱中備用。按照試劑操作說明書提取總RNA，以總RNA的1.0 μg為逆轉錄反應模板，進行逆轉錄，總的反應體積是20 μL，反轉錄合成cDNA，PCR擴增circRNA-000334片段。circRNA-0003340及內參照GAPDH的引物有上海生工生物工程公司合成設計。PCR的反應體積為20 μL，反應體系為40個循環，先95 ℃預變性30 s，然后95 ℃變性15 s，再把溫度降到60 ℃，30 s進行退火/延伸反應。本研究擬使用管家基因GADPH作為內參照。circRNA的相對表達使用經典方法-ΔΔCt法，即2-ΔΔCt，每個樣本重復3次，取平均值，2-ΔΔCt越大，代表circRNA的相對表達水平越高。

表1 用于分析circRNA-0003340表達水平的RT-qPCR引物

1.7 統計學方法

采用SPSS 23.0統計軟件和Graphpad Prism 8.0進行統計學分析。非正態分布的計量資料以中位數±四分位間距M（P25，P75），正態分布的計量資料以均數±標準差（±s）表示，采用Mann-Whitney U檢驗。Spearman相關分析2組間肝臟組織中circRNA-0003340的表達水平與各指標的相關性。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 各組生化指標及circRNA-0003340表達水平比較

與NC組比較，T2DM組的AST、ALT、FPG、HAb1c、FINs、HOMA-IR、TG、TC、LDL-C均升高（P＜0.05），HDL、circRNA-0003340的表達水平降低（P＜0.05），見表2、3。

表2 2組血清AST、ALT、FPG、HbA1c、FINs、HOMA-IR水平比較 （n=6）

表3 2組血脂水平比較 （n=6）

2.2 2組IPGTT及ITT結果比較

在0、15、30、60、90、120 min與NC組比較，T 2 D M 組的血糖水平均高于N C 組（P＜0.05），見圖1。

圖1 2 組IPGTT、ITT 結果比較

2.3 各組大鼠胰腺組織的HE染色

與NC組比較，T2DM組胰島細胞明顯縮小，胰島細胞之間的間隙增大，并且出現空泡變性。與T2DM比較，NC組胰島細胞更飽滿，數量更多（見圖2）。

圖2 2 組胰腺HE 染色（100×）

2.4 2組SD大鼠肝臟組織中circRNA-0003340的表達情況變化

circRNA-0003340在T2DM組大鼠肝臟組織中的表達較NC組大鼠肝臟組織中的表達下調，差異有統計學意義（P＜0.05），見圖3。

圖3 各組大鼠circRNA-0003340 在肝臟組織中的表達

2.5 SD大鼠肝臟組織中circRNA-0003340與生化指標的相關性分析

Sperman相關分析顯示，大鼠肝臟組織中circ-0003340表達水平與FPG、TG、TC呈負相關（r=-0.829、-0.943、0.886，P＜0.05，見表4）。

表4 大鼠肝臟組織circRNA-003340表達水平與各指標的相關性

3 討 論

circRNA大量存在于真核細胞內，具有高度穩定性、特異性、敏感性的表達特點，參與脂肪肝、胰島素抵抗、糖尿病及并發癥的發生發展［12］。circ-0003340是本課題組前期通過基因測序技術在健康人群與T2DM人群中篩選出的具有明顯差異性表達的circRNA，基因同源性分析發現同樣存在于大鼠體內。

已有多項研究證實了circRNA參與糖尿病及并發癥的發生發展。hsa-circ0054633可能通過調節細胞周期及細胞代謝，影響β細胞的增殖成為診斷T2DM的新生標志物［13］。糖尿病性腎病中circ-010383的下調通過作為miR-135a的海綿促進蛋白尿的形成及腎臟纖維化［14］。circ-RNA072097可能作為miR-3150a3p的海綿，通過調節KRAS在糖尿病足潰瘍中發揮作用［15］。糖尿病性視網膜病中circCOL1A2 在VEGF的作用下參與調節視網膜微血管內皮細胞的增殖與凋亡［16］。而此外，Liang等人［17］研究發現his-circRNA-0003340在食道鱗狀細胞癌中通過與海綿化mir-615-5p參與谷氨酰胺代謝及糖酵解過程，而肝臟是糖、脂代謝的重要器官，猜想circRNA可能也通過海綿化mir影響血糖水平，參與2型糖尿病的發生發展。Zhang等人［18］研究發現高血糖通過增加細胞內活性氧干擾電子運輸系統及糖酵解及ATP的產生，這將影響三羧酸循環（tricarboxylic acid cycle，TCA），而TCA是糖脂代謝的橋梁，間接影響SREBPs（是甾醇調節元件結合蛋白），從而誘導肝臟脂肪變性［19］，增加了非酒精性脂肪肝（nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD）的患病風險。最新證據顯示，T2DM是NAFLD的獨立危險因素，IR又是NAFLD重要發病機制，但未有強有力的證據表明糖尿病、IR、NAFLD之間有某種明確關聯。同時，circRNA具有一定的組織特異性與時間特異性，據組織特異性（tissue specific，TS）circRNA數據庫（http：//gb.whu.edu.cn/TSCD）顯示不同的組織circRNA的豐度有明顯的特異性，且與發育階段、物種相關，例如在成年人類中，食道、肝臟中TS circRNA的豐度很高，在胎兒時期，大腦、骨骼肌中TS circRNA的豐度更高，而在小鼠的大腦、睪丸組織中具有最高的TS circRNA豐度［20］。

本研究通過構建T2DM大鼠模型，測定SD大鼠的空腹血糖及分離SD大鼠的胰腺組織行HE染色和免疫熒光雙重證實造模的成功性及真實性。HE染色顯示T2DM大鼠的胰島體積較NC組明顯縮小，胰島個數明顯減少，在組織學水平再次提示T2DM造模成功。在本研究中T2DM的成模率約為50%，考慮與飼養SD大鼠的環境及大鼠習性相關，尤其是冬季室內溫度偏低，大鼠更具有攻擊性，彼此之間相互撕咬（大鼠尾巴、爪子），增加感染風險，從而降低了成模率。

本研究中，T2DM組血漿中的TG、TC、LDL-C明顯高于NC組，表現出明顯的脂代謝紊亂；AST、ALT水平高于NC組，表現出肝功受損；FPG、HAb1c、FINs、HOMA-IR水平均高于NC組，提示胰島素抵抗，這與韓等人［21］研究結果一致。IPGTT和ITT試驗表明T2DM組胰島素分泌節律異常，從而說明其T2DM組的胰島功能受損。相關分析顯示大鼠肝臟組織中circRNA-000334表達水平與F P G、T G、T C 呈負相關，提示circRNA-0003340可能參與糖脂代謝，促進2型糖尿病的發生發展。與NC組相比，T2DM組中circRNA-0003340在肝臟組織中表達水平下調，而本課題組前期研究發現在SD大鼠T2DM組的外周血中circRNA-0003340表達水平上調，這與本研究結果相悖［11］，查閱相關文獻提示其可能與環狀RNA的組織特異性或時間特異性相關。在Zhao等［22］研究中發現circRNA SCAR在非酒精性脂肪性肝炎的肝臟組織中的表達水平是下調的。Piwecka等人研究發現ciRS-7/CDR1as在腦組織中表達量最高，而在其他組織表達水平明顯低下，且病理狀態下會抑制circRNA的表達［23-24］，再次論證了circRNA功能的特殊性。

綜上所述，2 型糖尿病大鼠肝臟組織中circRNA-0003340的表達水平是明顯下調的，可能通過參與糖脂代謝來影響2型糖尿病的發生發展。