響應面法優化貝萊斯芽孢桿菌P9菌株生孢培養基及條件的研究

馬 爍 劉 瑾 趙 華

（天津科技大學生物工程學院 天津市微生物代謝與發酵過程控制技術工程中心 工業發酵微生物教育部重點實驗室 天津市工業微生物重點實驗室，天津 300457）

貝萊斯芽孢桿菌（Bacillus velezensis）屬于芽孢桿菌屬，為革蘭氏陽性細菌，菌體呈桿狀，可產孢子，是廣泛存在于環境中的多功能細菌[1-3]。貝萊斯芽孢桿菌具有來源廣、易篩選、培養周期短、抗逆性強、能形成芽孢、耐酸、耐堿、耐高溫、產酶豐富等優勢[4-6]。目前，關于貝萊斯芽孢桿菌的研究主要集中在病害防控、抑菌活性物質、動物病原菌拮抗作用機制等方面，廣泛應用于農業、食品等領域[7-10]。研究表明，貝萊斯芽孢桿菌可分泌豐富的木質纖維素降解酶，對纖維素酶的飼料化應用具有重要意義[11]。貝萊斯芽孢桿菌作為一種益生菌，可代替抗生素在水產及畜禽養殖中發揮積極作用[12-13]。本試驗采用單因素分析及響應面分析方法，確定貝萊斯芽孢桿菌P9最適生孢培養基，對菌株的生孢培養基進行進一步優化，以提高產酶量以及酶活性，為其在動物飼料生產中應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 菌株

貝萊斯芽孢桿菌（Bacillus velezensis）由天津科技大學工業發酵微生物重點實驗室組內提供。

1.2 培養基

LB 培養基：酵母浸粉5.0 g/L、蛋白胨10.0 g/L、氯化鈉10.0 g/L，pH 值為7.0。固體時添加瓊脂20.0 g/L，121 ℃滅菌20 min。

DSM培養基[14]：葡萄糖10.0 g/L、L-谷氨酸1.0 g/L、酵母浸粉0.5 g/L、KH2PO41.0 g/L、(NH4)3PO41.0 g/L、MgSO40.2 g/L、NaCl 0.1 g/L、CaCl20.05 g/L、MnCl20.007 g/L、ZnSO40.01 g/L、FeSO40.01 g/L，pH值為7.0。

SBM 培養基[15]：葡萄糖1.04 g/L、KH2PO46.0 g/L、MgSO4·7H2O 0.59 g/L、蛋白胨5.0 g/L、NaCl 0.01 g/L、0.1 mol/L 的 FeSO4·7H2O 1.136 mL、 0.1 mol/L 的ZnSO4·7H2O 300 μL、 0.1 mol/L 的 CaCl29.9 mL、0.1 mol/L的MnCl230 mL，pH值為7.0。

改良NA 培養基[16]：MgSO4·7H2O 0.51 g/L、KCl 0.97 g/L、 CaCl20.2 g/L、 MnSO4·7H2O 3×10-3g/L、FeSO4·7H2O 0.55×10-3g/L，pH值為7.0。

合成生孢培養基[17]： FeCl20.003 6 mmol/L、MgCl20.041 mmol/L、MnCl20.1 mmol/L、NH4Cl 10 mmol/L、NaSO40.75 mmol/L、CaCl21 mmol/L、KH2PO40.5 mmol/L、NH4NO31.2 mmol/L、葡萄糖10 mmol/L、L-谷氨酸10 mmol/L，pH值為7.0。

1.3 試驗方法

1.3.1 芽孢率測定

1.3.1.1 營養體的收集

防止菌體生長過程中出現結塊，在搖瓶中加入3～4 顆滅菌的玻璃珠。將3%菌種接種于100 mL 或250 mL LB 培養基，30 ℃、160 r/min 搖瓶培養24 h，8 000 r/min離心10 min，收集沉淀。所得沉淀用無菌生理鹽水重懸，混勻，8 000 r/min離心10 min，水洗，重復上述水洗步驟2次，再次離心得到水洗后的菌體。

1.3.1.2 生孢率計算

采用無菌生理鹽水稀釋涂布的方法測定培養基中的菌體數。稀釋度為10-6、10-7、10-8菌液涂布于LB固體平板上，30 ℃倒置培養24 h，記錄單菌落數量，得到的單菌落數為該稀釋度下的菌體總數。將所得的培養液于80 ℃條件下水浴20 min，采用無菌生理鹽水稀釋涂布的方法測定芽孢數[18]，稀釋度為10-6、10-7、10-8的菌液涂布于LB 平板上，30 ℃倒置培養24 h，記錄單菌落的數量，所得的單菌落數量即為孢子數。

1.3.2 基礎培養基確定

按照1.3.1所述方法收集4×100 mL培養液內的菌體，所得菌體用4 mL 生理鹽水重懸、混勻，分別吸取1 mL菌液轉接于DSM 培養基、改良NA 生孢培養基、合成生孢培養基、SBM 培養基中，30 ℃、160 r/min 搖瓶培養48 h，測定培養48 h 后各培養基菌體數與孢子數，計算生孢率，確定最適的基礎生孢培養基。

1.3.3 碳源對菌體生孢率的影響

1.3.3.1 碳源種類對生孢率的影響

可溶性淀粉、蔗糖、果糖、麥芽糖、葡萄糖作為唯一的碳源進行芽孢率的測定。收集各碳源培養液內的菌體，所得菌體使用5 mL生理鹽水重懸、混勻，分別移取1 mL 菌懸液至100 mL 或250 mL 的不同種類的碳源基礎培養基中，30 ℃、160 r/min 搖瓶培養48 h，測定不同培養基中的菌體數與孢子數，計算生孢率。

1.3.3.2 碳源含量對生孢率的影響

碳源含量設為0、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%，收集5×100 mL 或5×250 mL 培養液內的菌體，所得菌體用5 mL 生理鹽水重懸，混勻，分別移取1 mL菌液至100 mL或250 mL不同含碳量培養基中，30 ℃、160 r/min搖瓶培養48 h，測定培養基中的菌體數和孢子數，計算生孢率。

1.3.4 氮源對菌體生孢率的影響

1.3.4.1 氮源種類對生孢率的影響

牛肉膏、蛋白胨、酵母浸粉、胰蛋白胨、大豆蛋白胨、硫酸銨作為唯一氮源替換基礎培養基的氮源制備氮源基礎培養基。收集各氮源培養液內的菌體，所得菌體用6 mL 生理鹽水重懸，混勻，分別移取1 mL 菌懸液至100 mL 或250 mL 的不同氮源種類的基礎培養基中，30 ℃、160 r/min 搖瓶培養48 h，測定各培養基中的菌體數和芽孢數，計算生孢率。

1.3.4.2 不同氮源配比對生孢率的影響（見表1）

表1 不同氮源配比對生孢率的影響 單位：%

在已知上述確定條件下，分別挑選作為唯一氮源條件下生孢率最高的兩種氮源，根據氮源種類的優化結果選擇最優和次優氮源，并按表1 調整兩種氮源的配比，酵母浸粉并且以單一的兩種氮源為對照，制備不同氮源配比的基礎培養基，收集氮源培養液內的菌體，所得菌體用5 mL 生理鹽水重懸，混勻，分別吸取1 mL 菌懸液添加到100 mL 或250 mL 的不同氮源配比的培養基中，30 ℃、160 r/min 搖瓶培養48 h，測定此時的菌體數和芽孢數，計算生孢率。

1.3.4.3 氮源含量對生孢率的影響

分別調整培養基中氮源的含量為0、4%、8%、12%、16%制備不同含氮量的培養基，收集氮源培養液內的菌體，所得菌體用5 mL 生理鹽水重懸，混勻，分別吸取1 mL 菌懸液添加至100 mL/250 mL 的不同含氮量培養基中，30 ℃、160 r/min 搖瓶培養48 h，測定不同培養基中的菌體數和芽孢數，計算生孢率。

1.3.5 金屬離子對生孢率的影響

1.3.5.1 Ca2+、Mn2+、Fe2+、Zn2+對菌體生孢率的影響

分別添加1 mol/L 的CaCl2、MnCl2、FeCl2、ZnCl22、4、6、8 mL，以不添加CaCl2、MnCl2、FeCl2、ZnCl2的培養基為對照。30 ℃、160 r/mi搖瓶培養48 h，記錄菌體數和芽孢數，計算生孢率。

1.3.5.2 Mg2+對菌體生孢率的影響

分別添加0.4%、0.8%、1.2%、1.6%的MgCl2，以不添加MgCl2的培養基為對照，30 ℃、160 r/min 搖瓶培養48 h后記錄菌體數和芽孢數，計算生孢率。

1.3.6 最陡爬坡試驗設計（見表2）

表2 最陡爬坡試驗設計

在單因素試驗基礎上，以菌體生孢率為響應值（Y），選取3 個影響最大的因素葡萄糖（X1）、復合氮源（X2）和Mg2+（X3），利用Design Expert 10.0 軟件進行Box-Behnken試驗設計，確定培養基成分最佳組合和最優值。

1.3.7 響應面試驗因素水平設計（見表3）

表3 響應面試驗因素水平設計

在最陡爬坡試驗的基礎上，利用Design Expert 10.0軟件，葡萄糖（X1）、復合氮源（X2）和Mg2+（X3）對菌體生孢率（Y）的影響進行響應面試驗，利用響應面法研究各個因素對菌體生孢率的影響，進一步確定培養基成分的最佳組合和最優值。

2 結果與分析

2.1 不同培養基對Bacillus velezensis P9 產孢量的影響（見圖1）

圖1 不同培養基對Bacillus velezensis P9產孢量的影響

由圖1 可知，Bacillus velezensisP9 在DSM 培養基和SBM培養基生孢率最高，而其中通過使用SBM培養基進行菌體培養時，菌體濃度可達到162×109/mL。因此選用SBM培養基作為生孢培養基優化的基礎培養基。

2.2 生孢培養基優化結果

2.2.1 碳源對Bacillus velezensisP9 產孢量的影響（見圖2）

圖2 碳源對Bacillus velezensis P9產孢量的影響

由圖2 可知，使用葡萄糖作為碳源時，菌體的生孢率最高，可達到77.056%，而使用麥芽糖作為碳源時，生孢率最低，只有58.132%，但此時菌體濃度較高，可能是由于麥芽糖對菌株的生長發育有很大影響，但并不適合用來做生孢培養基的碳源。因此本試驗采用葡萄糖作為培養基的碳源。

2.2.2 葡萄糖對Bacillus velezensisP9 產孢量的影響（見圖3）

圖3 葡萄糖含量對Bacillus velezensis P9產孢量的影響

由圖3 可知，當葡萄糖含量低于0.2%時，生孢率隨著葡萄糖濃度的增加而增加，最大值為78.1%，原因是少量的葡萄糖為菌體生孢提供了能量，使更多的菌體轉化為芽孢。隨著葡萄糖含量的增加，菌體濃度變化不大，生孢率下降，可能是因為過多的葡萄糖為菌體生命活動提供了能力，使菌體并未轉化成芽孢[19]。因此，生孢培養基中葡萄糖的添加量為0.2%。

2.3 氮源對菌體生孢率的影響

2.3.1 氮源對Bacillus velezensisP9 產孢量的影響（見圖4）

圖4 氮源對Bacillus velezensis P9產孢量的影響

由圖4 可知，使用酵母浸粉或牛肉膏作為培養基氮源，生孢率較高，使用酵母浸粉時生孢率最高，使用牛肉膏時菌體濃度較大。使用硫酸銨作為培養基氮源時，生孢率和菌體數較低，因此，可采用酵母浸粉與牛肉膏進行復配制備復合氮源進一步對培養基的氮源進行優化。

2.3.2 氮源配比對Bacillus velezensisP9 產孢量的影響（見圖5）

圖5 氮源配比對Bacillus velezensis P9產孢量的影響

由圖5 可知，菌體濃度隨著牛肉膏濃度的降低而降低。當牛肉膏∶酵母浸粉=1∶1 時生孢率最大，為79.7%，綜合考慮菌體濃度和生孢率，選用牛肉膏∶酵母浸粉=1∶1作為生孢培養基的氮源。

2.3.3 氮源含量對Bacillus velezensisP9 產孢量的影響（見圖6）

圖6 氮源含量對Bacillus velezensis P9產孢量的影響

按照1∶1 的配比分別添加0、0.4%、0.8%、1.2%、1.6%的牛肉膏和酵母浸粉作為生孢培養基的氮源。由圖6 可知，隨著氮源含量增加，菌體濃度具有一定的增加趨勢，最后趨于平穩，但是生孢率會隨著氮源含量的增加先增后減。這可能是氮源濃度過大時，并不能刺激菌體產生芽孢所需要的酶，反而為菌體的其他生命活動提供了物質基礎。當氮源含量較少時，不能為菌體轉化為孢子的過程提供物質基礎，而且影響了菌體的其他活動，因此，牛肉膏∶酵母浸粉比例為1∶1，含量為0.8%作為生孢培養基的氮源[20]。

2.4 金屬離子對菌體生孢率的影響

2.4.1 Ca2+對Bacillus velezensisP9 產孢量的影響（見圖7）

圖7 Ca2+對Bacillus velezensis P9產孢量的影響

由圖7可知，隨著Ca2+水平增加，菌體濃度和生孢率均有所增加，當Ca2+水平增加到6×10-3mol/L時生孢率達到最大，為93.21%，繼續增加Ca2+濃度，生孢率開始下降。因此，添加6 mL 1 mol/L CaCl2溶液進行后續試驗。

2.4.2 Mn2+Bacillus velezensisP9產孢量的影響（見圖8）

圖8 Mn2+對Bacillus velezensis P9產孢量的影響

由圖8 可知，隨著Mn2+水平的增加，菌體的生孢率也增加，當Mn2+水平增加至8×10-3mol/L 時生孢率達到最大，為91.53%。因此，本試驗添加8 mL 1 mol/L 的MnCl2溶液進行后續試驗。

2.4.3 Fe2+對Bacillus velezensisP9 產孢量的影響（見圖9）

圖9 Fe2+對Bacillus velezensis P9產孢量的影響

由圖9可知，不添加Fe2+進行生孢培養時，生孢率和菌體濃度均最大，其中生孢率為93.25%，菌體濃度為1.88×109/mL，隨著Fe2+水平增加，培養液中的菌體濃度和生孢率持續下降，表明Fe2+可能并不能起到促進菌體生孢的作用。因此后續試驗不添加Fe2+。

2.4.4 Zn2+對Bacillus velezensisP9 產孢量的影響（見圖10）

圖10 Zn2+對Bacillus velezensis P9產孢量的影響

由圖10 可知，不添加Zn2+進行菌體的生孢培養時，Bacillus velezensisP9 生孢率最大，為91.15%。隨著Zn2+濃度增加，菌體生孢率持續下降，而菌體濃度無明顯變化，可能是Zn2+對菌體生孢并無有益影響。因此，后續不添加Zn2+進行試驗。

2.4.5 Mg2+對Bacillus velezensisP9 產孢量的影響（見圖11）

圖11 Mg2+對Bacillus velezensis P9產孢量的影響

由圖11可知，當MgCl2質量濃度小于8 g/L時，隨著Mg2+水平增加，菌體的生孢率增加，當MgCl2質量濃度達到8 g/L時達到最大，此時的生孢率為94.65%，繼續增加Mg2+水平，生孢率開始下降，可能是過量的Mg2+會對菌體生芽孢產生抑制作用。因此，本試驗添加MgCl2的質量濃度為8 g/L。

2.5 爬坡試驗結果

葡萄糖濃度為2g/L，復合氮源濃度為8 g/L，Mg2+濃度為8 g/L時，生孢效果達到最優。

2.6 響應面試驗及方差分析結果（見表4、表5）

表4 響應面試驗結果

表5 方差分析結果

通過Design Expert 10.0軟件對表4數據進行多元線性回歸分析，得到擬合試驗因素的回歸方程：

Y=95.07+0.87X1-0.41X2-0.58X3-0.43X1X2+0.24X1X3+0.34X2X3-2.12X12-2.20X22-0.67X32。

通過Design Expert 10.0 軟件對響應面試驗進行方差分析。由表5可知，該模型P值為0.000 4＜0.01，具有極顯著影響，失擬項P值為0.158 3＞0.05，不顯著，表明該模型和試驗擬合度較好。模型的決定系數R2為0.962 2，校正后的決定系數R2為0.915 3，變異系數（C.V.）為0.61%，表示該模型有0.61%的變異不能由該模型解釋，說明試驗操作和模型可信。

2.7 各因素交互作用對生孢率的影響（見圖12）

圖12 各因素交互作用對生孢率的影響

由圖12（a）可知，當Mg2+的質量濃度為8.0 g/L時，葡萄糖和復合氮源質量濃度分別為1.75～2.25 g/L和7.75～8.25 g/L。

由圖12（b）可知，當復合氮源質量濃度為8.0 g/L時，葡萄糖和Mg2+質量濃度范圍分別為1.75～2.50 g/L 和7.0～8.25 g/L。

由圖12（c）可知，當葡萄糖濃度為8.0 g/L時，復合氮源和Mg2+質量濃度范圍分別為7.75～8.25 g/L 和7.0～8.25 g/L。

通過Design-Expert 10.0 分析，發現葡萄糖質量濃度為2.124 g/L，復合氮源質量濃度為8.272 g/L 和Mg2+質量濃度為8.272 g/L時，生孢率最大為94.65%，與以上分析一致。

2.8 驗證試驗

為了驗證Design-Expert 10.0軟件所預測的最佳試驗條件，考慮現實操作條件，調整發酵條件為葡萄糖2.0 g/L、牛肉膏4.0 g/L、酵母浸粉4.0 g/L，MgCl28.0 g/L、KH2PO46.0 g/L、NaCl 0.01 g/L、1 mol/L 的CaCl26 mL、1 mol/L 的MnCl26 mL。在此條件下進行3 次平行試驗，得到發酵液生孢率為95.37%，比預測值94.65%高約0.73%，此差值在可接受范圍內。在未優化的培養條件下，生孢率為64.53%[21]。本試驗比未優化培養基生孢率增加了30.84%。

3 結論

對Bacillus velezensisP9進行生孢培養基的優化，確定最佳的生孢培養基成分為葡萄糖2.0 g/L、牛肉膏4.0 g/L、酵母浸粉4.0 g/L、MgCl28.0 g/L、KH2PO46.0 g/L、NaCl 0.01 g/L、1 mol/L的CaCl26 mL、1 mol/L的MnCl26 mL，此時芽孢率為95.37%。