不同濃度葡萄糖對大鼠INS-1 細胞的影響研究

范曉宇，徐子凱，柳雨菲，吳莞茹，李磊，何新怡，徐晶

1.齊齊哈爾醫學院醫學技術學院檢驗專業，黑龍江齊齊哈爾 161006；2.齊齊哈爾醫學院生化教研室，黑龍江齊齊哈爾 161006

隨著我國人口老齡化和生活水平的提高，糖尿病患病率逐年上升，其中70%～80%為2 型糖尿病（type 2 diabetes mellitus, T2DM），糖尿病是常見的慢性代謝性疾病，常伴有糖尿病心肌病、糖尿病腎病、糖尿病性視網膜病等糖尿病并發癥，胰島素抵抗是該病的主要特征，胰島素抵抗是由于胰島素分泌或者功能缺陷引起的綜合特征[1-4]。胰島素在生物體內調節能量代謝方面具有重要作用，也是糖尿病患者管理血糖達標的關鍵[5-9]。因此，對胰島β 細胞活力、功能及胰島素分泌情況的研究逐漸引起學者們關注。

大鼠胰島INS-1 細胞具有正常胰島β 細胞的大部分功能，能較好地對生理濃度葡萄糖的刺激做出應答，分泌較多的胰島素，這種高度敏感性是由于細胞內氧自由基清除的酶類較少所致[10-12]。因此，本研究于2020年9 月—2021年6 月在齊齊哈爾醫學院醫藥科學院分子生物學中心完成體外高糖誘導大鼠胰島INS-1 細胞，檢測不同濃度葡萄糖刺激胰島β 細胞的胰島素含量的變化，為選用提高胰島素分泌量的藥物提供實驗數據。現報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞及主要試劑 大鼠胰島INS-1 細胞（中國醫學科學院基礎醫學研究所基礎醫學細胞中心）；RPMI 1640 培養基（Hyclone）；胎牛血清（Clark）；0.25%胰酶（gibco）；活性氧簇（reactive oxygen species, ROS）檢測探針和葡萄糖（Sigma）；CCK-8 檢測試劑盒（上海生工）；大鼠胰島素（insulin）酶聯免疫檢測試劑盒（北京索來寶科技有限公司）。

1.1.2 儀器 酶標儀（Spark）；生物安全柜（Thermo）；倒置熒光顯微鏡（OLYMPUS）；離心機（eppendorf）；激光共聚焦（ZEISS 710）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養與分組 將大鼠INS-1 細胞培養在含10% 胎牛血清的1640 培養基中，37°C 5% CO2細胞培養箱中。在1640 培養基中加入一定質量的葡萄糖，待充分溶解后，0.22 μm 針孔過濾器過濾，配置成濃度為5.5、16.7、25、33、50 mmol∕L 的葡萄糖。實驗分組：1640 正常培養組，即對照組（normal control, NC），不同濃度葡萄糖組，分別為5.5、16.7、25、33、50 mmol∕L。

1.2.2 CCK-8 檢測細胞存活率 將培養的100 μL大鼠胰島INS-1 細胞以5×104∕mL 密度的懸液接種在96 孔細胞培養板中，37°C 5% CO2的細胞培養箱中培養24 h 后，棄掉培養基，PBS 清洗3 次，按照上述分組加入不同濃度葡萄糖的培養基，培養48 h，每孔加入10 μL CCK-8 試劑后，繼續孵育2 h 后在450 nm 處檢測吸密度（OD）值，根據如下公式計算細胞存活率。

細胞存活率（%）=（實驗孔-空白孔）∕（對照孔-空白孔）×100%。

1.2.3 胰島素分泌檢測 將細胞以50 萬∕孔的密度接種在6 孔細胞培養板中，細胞貼壁率達到70%～80%時，按照上述分組分別加入不同濃度葡萄糖的培養基，培養48 h 后，收集上清和細胞沉淀。上清低速離心（1 000 rpm，1 min）棄掉細胞，沉淀用裂解液100 μL 冰浴裂解10 min，漩渦震蕩2～3 次，12 000 rpm 離心15 min，收集上清。將培養液上清和沉淀裂解上清分別按照大鼠胰島素酶聯免疫檢測試劑盒說明書操作，在450 nm 波長處檢測光密度值，根據標準曲線計算各組胰島素釋放量和細胞內含量。

1.2.4 ROS 水平檢測 將細胞以5 000 個∕孔的密度接種在96 孔細胞培養黑色板中，貼壁后加入不同糖濃度培養48 h 后，每孔加入100 μL 培養基配制的濃度為10 μmol∕L 的DCFH-DA 探針，置于37°C 5%CO2細胞培養箱中30 min，PBS 清洗2 次，最后加入100 μL PBS，在酶標儀中測定熒光強度，激發波長為485 nm，發射波長為521 nm。

1.3 統計方法

采用SPSS 22.0 和GraphPad Prism 統計學軟件對數據進行處理，計量資料經檢驗符合正態分布，以（±s）表示，組間差異比較采用t檢驗，P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 大鼠胰島INS-1 細胞的培養

將大鼠INS-1 細胞從-80°C 冰箱取出立刻放于37°C 水浴鍋中解凍，待溶解后將細胞打入含1640培養基的25 cm2細胞培養瓶中，置于37°C 5% CO2細胞培養箱中培養24 h 后，更換培養液，倒置顯微鏡下觀察細胞狀態，見圖1。

圖1 大鼠胰島INS-1 細胞的培養（20×）

2.2 不同濃度葡萄糖時大鼠INS-1 細胞活力比較

大鼠INS-1 細胞培養在不同濃度葡萄糖培養液中培養48 h 后，對照組（NC）（1.047±0.101）與體外5.5、16.7、25、33 mmol∕L 糖濃度時的大鼠INS-1 細胞活力[（0.933±0.100），（0.846±0.117），（0.884±0.035），（0.914±0.040）]比較，差異無統計學意義（P＞0.05），但糖濃度為50 mmol∕L 時，細胞存活率（0.727±0.096）顯著下降，與對照組比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。見圖2。

圖2 不同濃度葡萄糖時大鼠INS-1 細胞活力

2.3 不同濃度葡萄糖時大鼠INS-1 細胞胰島素釋放水平比較

與對照組比較，不同濃度葡萄糖培養的INS-1 細胞胰島素釋放量、細胞內胰島素含量、胰島素總量都顯著減少，差異有統計學意義（P＜0.05）；33 mmol∕L 糖濃度時最低[（0.207±0.008）、（0.224±0.014）、（0.451±0.079）]，50 mmol∕L 糖濃度時有升高趨勢[（0.315±0.011）、（0.374±0.011）、（0.660±0.109）ng∕mL]。見圖3。

圖3 不同糖濃度時INS-1 細胞胰島素釋放水平

2.4 不同濃度葡萄糖時大鼠INS-1 細胞ROS 比較

在激光共聚焦顯微鏡下顯示，對照組（NC）細胞內活性氧（1.028±0.065）與低濃度葡萄糖（5.5 mM）時（0.645±0.075）比較，差異無統計學意義（P＞0.05）；當葡萄糖濃度超過16.7 mM 后，細胞內的活性氧水平（1.85±0.102）也逐漸升高，均高于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）。其中33 mM 時最高（18.382±0.887），50 mM（3.209±0.607）比33 mM 低。見圖4。

圖4 不同糖濃度時INS-1 細胞活性氧水平

3 討論

糖尿病是全球致死率較高的疾病之一，目前尚無治愈糖尿病的技術手段。血糖代謝異常是糖尿病的主要特點，原因主要胰島素分泌不足和胰島素抵抗（insulin resistance，IR）兩個因素。胰島β 細胞數量及功能是關系到胰島素分泌量的關鍵，因此本文將尋找影響胰島素分泌的因素，進而再研究保護胰島β 細胞功能的藥物[13-19]。

本研究在體外使用不同濃度葡萄糖刺激大鼠胰島INS-1 細胞發現，細胞活力在5.5、16.7、25、33 mmol∕L 糖濃度時，大鼠INS-1 細胞活力與對照組比較，差異無統計學意義（P＞0.05），但糖濃度為50 mmol∕L 時，細胞存活率與對照組相比顯著下降（P＜0.05）。有研究表明體外葡萄糖濃度25 mmol∕L相當于正常血糖值餐后高值7 mmol∕L[9]，體外葡萄糖濃度50 mmol∕L 時抑制胰島細胞活力，相當于正常血糖值餐后高值14 mmol∕L。在不同濃度葡萄糖刺激下，胰島素釋放量都顯著減少（P＜0.05），33 mmol∕L 糖濃度時胰島素釋放量最低，50 mmol∕L糖濃度時胰島素釋放量有升高趨勢，細胞內胰島素含量和胰島素總量變化趨勢與胰島素釋放量一致，提示大鼠胰島INS-1 細胞在受葡萄糖刺激時分泌胰島素總量會隨著濃度的升高逐漸降低，當50 mmol∕L 糖濃度時，胰島細胞應激性提高胰島素的分泌量來維持血糖的穩定，本研究預測隨著糖濃度的再升高，胰島素將無法維持血糖平衡，因為胰島β 細胞數量及功能是有限的。在活性氧檢測實驗中發現，體外低濃度葡萄糖（5.5 mM）時，細胞內活性氧與對照組比較，差異無統計學意義（P＞0.05），當葡萄糖濃度超過16.7 mM 后細胞內的活性氧水平也逐漸升高（P＜0.05），其中33 mM 時最高，然而50 mM 時活性氧水平比33 mM 低，但與對照組比較，差異有統計學意義（P＜0.05），提示當葡萄糖濃度在50 mM 時細胞內可能啟動抗氧化應激來抵抗高糖對細胞損傷的機制，這個結果與胰島素釋放量保持一致，因此驗證細胞內ROS 的產生與胰島素抵抗密切相關。

綜上所述，不同濃度葡萄糖影響大鼠胰島INS-1 細胞胰島素釋放量和細胞內ROS 的水平，將為體外高糖損傷模型的建立和臨床藥物的選取提供實驗依據。