分光光度法測定蕎麥粉中總黃酮含量的不確定度評定

雒曉玲

（山西省檢驗檢測中心（山西省標準計量技術研究院），山西太原 030012）

蕎麥中總黃酮含量的測定是衡量蕎麥質量的重要指標之一[1]。分光光度法作為食品檢驗檢測機構測定蕎麥及其制品中總黃酮含量的常規方法，對其進行不確定度評定，分析影響檢測結果的主要因素十分必要[2]。本研究參照《蕎麥及其制品中總黃酮含量的測定》（NY/T 1295—2007）[3]測定蕎麥粉中總黃酮含量（以蘆丁為對照品），依據《測量不確定度評定與表示》（JJF 1059.1—2012）[4]中規定的方法程序對其不確定度進行分析和評定。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蕎麥粉（500 g/袋），購自某糧油商店；蘆丁標準品（純度99.0%），壇墨質檢-標準物質中心；三氯化鋁（分析純），上海埃彼化學試劑有限公司；乙酸鉀（分析純），宜興阿拉丁化工貿易有限公司。

1.2 儀器與設備

721G 可見分光光度計，上海儀電控股（集團）公司；AL104 電子天平，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；SHA-B 恒溫水浴振蕩器，常州金壇恒豐儀器制造有限公司等。

1.3 測定方法步驟

1.3.1 標準曲線繪制

（1）標準儲備液配制。準確稱取0.050 0 g 蘆丁標準品于100 mL 燒杯中，加入甲醇水溶液（7+3）溶解，轉移入1 000 mL 容量瓶中，用甲醇水溶液（7+3）稀釋并定容，配制成0.050 0 mg·mL-1的蘆丁標準儲備液。

（2）工 作 曲 線 繪 制。 準 確 吸 取0.25 mL、0.50 mL、1.00 mL、2.00 mL、3.00 mL 和4.00 mL 蘆丁標準儲備液于10 mL 容量瓶，分別加入2 mL 三氯化鋁（0.1 mol·L-1）溶液、3 mL 乙酸鉀（1 mol·L-1）溶液，加入甲醇并定容至刻度，配制成蘆丁濃度分別為0 0..0 01 001 0 205 mmgg··mmLL--11、、00.0.0 1 0520500mmg·gm·mLL-1-1和、00..002005 0000 mmgg··mmLL--11、的標準工作系列。室溫下放置0.5 h 后，使用分光光度計在波長λ=420 nm 處測定吸光度，以標準系列濃度值為橫坐標，測得吸光度值為縱坐標，繪制標準曲線。

1.3.2 試樣溶液制備

準確稱取0.400 0 （g精確至0.000 1 g）蕎麥粉試樣置于具塞三角瓶中，加入30 mL 甲醇水溶液（7+3），蓋緊瓶塞后放入65 ℃的恒溫水浴振蕩器中以160 r·min-1的頻率振搖2 h，趁熱過濾至50 mL 容量瓶中，再用甲醇水溶液（7+3）洗滌濾紙與殘渣，將濾液并入容量瓶中，并用甲醇水溶液（7+3）定容，搖勻后待測。

1.3.3 待測試液測定

準確吸取1.0 mL 待測試液于10 mL 容量瓶中，分別加入2 mL 三氯化鋁（0.1 mol·L-1）溶液、3 mL 乙酸鉀（1 mol·L-1）溶液，加入甲醇并定容至刻度，搖勻，室溫下放置0.5 h，置于4 000 r·min-1的離心機中離心10 min，使用分光光度計在波長λ=420 nm 處測得吸光值，計算得待測試液中的總黃酮濃度。

2 結果與分析

2.1 不確定度分析

2.1.1 數學模型建立

蕎麥粉中總黃酮含量的計算公式為

式中：w為蕎麥粉中總黃酮含量，g/100 g；C為待測試液中總黃酮濃度，mg·mL-1；V為待測試液體積，mL；D為試樣總稀釋倍數，D=500；H為試樣水分的質量分數，測得H=12.40；m為稱樣量，g。

2.1.2 不確定度來源

結合方法測定步驟和建立的數學模型，可確定該試驗過程中可能引入的不確定度來源：標準溶液配制引入的不確定度（包括標準品賦值、標準儲備液及標準系列配制）；試樣溶液制備及測定引入的不確定度（包括試樣稱量、試液移取及定容等）；標準曲線擬合引入的不確定度及重復測定引入的不確定度。

2.2 不確定度分量評定

2.2.1 標準溶液配制引入的不確定度分量urel(c)

（1）標準品賦值。蘆丁標準品的編號為710100-100 mg，批號為23040089，標準品證書中的相對擴展不確定度為U=kurel(p)=0.008（k=2），由此其產生的相對不確定度為urel(p)=0.004。

（2）標準儲備液配制過程。稱取0.050 0 g 蘆丁標準品使用AL104 電子天平，由檢定證書上得到其線性允差為0.1 mg，假設為三角分布，故標準不確定度為g，相對不確定度為。定容使用1 000 mL 單標線容量瓶（A 級），根據《常用玻璃量器檢定規程》（JJG196—2006）[5]，20 ℃時實驗中所用各種A級玻璃量器的不確定度分量按矩形分布，取。假設實驗溫差為±5℃，水膨脹系數為2.10×10-4/℃，溫差變化引入的不確定度按照矩形分布計算，取，結果見表1。標準儲備液配制產生的相對不確定度分量為。

表1 玻璃量器引入的相對不確定度

（3）標 準 系 列 配 制 過 程。 吸 取0.25 mL、0.50 mL、1.00 mL 蘆丁標準儲備液使用1 mL 分度吸量管（A 級），吸取2.0 mL、3.0 mL、4.0 mL 蘆丁標準儲備液使用5 mL 分度吸量管（A 級），定容使用10 mL 單標線容量瓶（A 級）。玻璃量器各自引入的相對不確定度見表1，其中，，。為避免重復評定，多次使用的玻璃量器只計算1 次，標準系列配制產生的相對不確定度分量為

2.2.2 試液制備及測定引入的不確定度分量urel(x)

（1）試樣溶液制備過程。稱取0.400 0 g 蕎麥粉試樣使用AL104 電子天平，其線性允差為0.1 mg，假設為三角分布，標準不確定度為， 相對不確定度為。定容使用50 mL 單標線容量瓶（A 級），各自引入的相對不確定度見表1，該過程產生的相對不確定度分量為

（2）待測試液測定過程。吸取1.0 mL 待測試液使用1 mL 分度吸量管（A 級），定容使用10 mL 單標線容量瓶（A 級），各自引入的相對不確定度見表1，該過程產生的相對不確定度分量為

由此，試液制備測定過程產生的不確定度分量

2.2.3 標準曲線擬合引入的不確定度分量urel(q)

將配制的蘆丁標準系列溶液重復測定3 次，檢測數據統計于表2，用最小二乘法擬合線性回歸方程，蘆丁質量濃度在0.001 25 ～0.020 00 mg·mL-1時，I=35.956C+0.006 1，b=35.956，a=0.006 1。該過程產生的標準不確定度計算公式為

式中：n為標準系列測定次數，n=18；P為蕎麥粉試樣測定次數，P=6。蕎麥粉試樣中總黃酮測定平均值為0.33 g/100 g，代入2.1.1 數學模型中，計算得C=0.00231 mg·mL-1，標準系列溶液平均濃度為，，，SR=0.00883。由此可得，u(q)=0.000152，相對標準不確定度為urel(q)=。

2.2.4 重復測定引入的不確定度分量urel(s)

將購自某糧油商店的蕎麥粉試樣在期間精密度條件下（重復測定6 次，結果分別為0.32 g/100 g、0.33 g/100 g、0.32 g/100 g、0.34 g/100 g、0.32 g/100 g 和0.35 g/100g，測定平均值為0.33 g/100 g，標準偏差s為0.012 65。該過程的標準不確定度為，產生的相對標準不確定度分量。

2.3 合成不確定度和擴展不確定度評定

2.3.1 合成不確定度

按方和根公式計算得

2.3.2 擴展不確定度

取包含因子k=2，近似95%置信概率，總黃酮含量的測量擴展不確定度U=ku=0.02 g/100 g。

2.4 測量不確定度結果

分光光度法測定蕎麥粉中總黃酮含量的測量不確定度結果為（0.33±0.02）g/100 g，k=2，P=95%。

3 結論

通過對分光光度法測定蕎麥粉中總黃酮含量的不確定度分析評定與計算合成，試驗過程中產生不確定度各分量的影響順序大小為標準曲線擬合＞重復測定＞標準溶液配制＞試樣制備檢測。可見在理化項目檢驗中人為操作因素對實驗結果的影響較大，食品檢驗檢測機構應加強對一線檢驗人員的專業培訓，從事理化檢驗項目的人員也需重視基礎操作技能水平的提升，以提高檢驗檢測結果的準確性。