一起副溶血性弧菌食源性聚集事件的實(shí)驗(yàn)室檢測及病原分析

李佳琪，羅昱玥，章興隆，劉義萍，周瑩冰

（重慶市渝中區(qū)疾病預(yù)防控制中心，重慶 400010）

副溶血性弧菌是一類革蘭氏陰性無芽孢桿菌，具有嗜鹽性，可引起人類多種不同疾病，如敗血癥、急性胃腸炎、傷口感染等[1]。副溶血性弧菌最早于1950 年從日本1 例食物中毒的病人糞便中初次分離得到，是最常見的食源性致病菌之一，在近海岸的海水、海產(chǎn)品、海底沉積物中廣泛存在。由于海產(chǎn)品在運(yùn)輸和銷售中會(huì)交叉污染，導(dǎo)致副溶血性弧菌在淡水產(chǎn)品中也被大量檢出。人們攝入被副溶血性弧菌污染的食品會(huì)引發(fā)食物中毒，導(dǎo)致患者出現(xiàn)惡心、嘔吐、腹痛、腹瀉和發(fā)燒等典型急性胃腸炎反應(yīng)。副溶血性弧菌是細(xì)菌性食物中毒事件中的重要病原體。2021 年4 月18 日，渝中區(qū)疾病預(yù)防控制中心接到某醫(yī)院電話報(bào)告稱“某游輪出現(xiàn)10 余名疑似食物中毒病人”，立即趕往醫(yī)院與游輪現(xiàn)場進(jìn)行流行病學(xué)調(diào)查，采集肛拭子，留樣食品進(jìn)行檢測。根據(jù)患者的臨床表現(xiàn)、流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果、實(shí)驗(yàn)室檢測結(jié)果綜合研判，認(rèn)為本次事件是一起由副溶血性弧菌引起的食源性聚集事件。為進(jìn)一步了解陽性菌株的病原學(xué)特征以及各菌株之間的相關(guān)性，本研究對(duì)分離的副溶血弧菌進(jìn)行血清學(xué)鑒定、實(shí)時(shí)熒光PCR 鑒定毒力基因、脈沖場凝膠電泳（Pulsed Field Gel Electrophoresis，PFGE）分子分型和藥敏試驗(yàn)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

顯色培養(yǎng)基，科瑪嘉微生物技術(shù)有限公司；其余培養(yǎng)基，北京陸橋技術(shù)股份有限公司；副溶血性弧菌血清，日本生研公司；病毒核酸提取試劑盒（磁珠法），江蘇碩世生物科技有限公司；諾如病毒G Ⅰ/G Ⅱ雙重?zé)晒釶CR 檢測試劑盒、食源性致病菌核酸多重實(shí)時(shí)熒光PCR 檢測試劑盒、副溶血性弧菌（tdh、trh、tlh）三重核酸檢測試劑盒，北京卓誠惠生生物科技有限公司；VITEK 2 Compact GN 鑒定卡，法國生物梅里埃股份有限公司；限制性內(nèi)切酶Xba Ⅰ、Not Ⅰ，日本TaKaRa 生物工程有限公司；瓊脂糖SeaKem Gold Agarose，瑞士LONZA；蛋白酶K，北京索萊寶科技有限公司；革蘭陰性菌藥敏檢測卡（CHNENF)，賽默飛世爾科技有限公司。

1.2 設(shè)備與儀器

SSNP-9600A 全自動(dòng)核酸提取儀，江蘇碩世生物科技有限公司；VITEK 2 Compact 全自動(dòng)微生物生化鑒定儀，法國生物梅里埃股份有限公司；CFX96實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀，美國Bio-Rad 公司；CHEF Mapper 脈沖場凝膠電泳儀及凝膠成像系統(tǒng)，美國Bio-Rad 公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 樣品來源

采集樣品28 件，其中病例肛拭標(biāo)本13 件，留樣食品15 份，病例肛拭標(biāo)本一式兩份，分別存放于Cary-Blair 運(yùn)送培養(yǎng)基和病毒采樣液中，及時(shí)送至實(shí)驗(yàn)室檢測。

1.3.2 病原菌的分離鑒定

對(duì)采集樣品進(jìn)行諾如病毒和食源性致病菌實(shí)時(shí)熒光PCR 檢測，按照國家標(biāo)準(zhǔn)對(duì)沙門氏菌、空腸彎曲菌、副溶血性弧菌和致瀉性大腸埃希氏菌等病原菌進(jìn)行增菌分離培養(yǎng)。

1.3.3 血清學(xué)試驗(yàn)

取新鮮分離培養(yǎng)的副溶血性弧菌菌苔至含3%氯化鈉的5%甘油溶液中，研磨乳化均勻，121 ℃高壓1 h，4 000 r·min-1離心15 min，吸取上清液，加入等體積的生理鹽水重懸，玻片凝集檢測O 抗原，生理鹽水作為自凝對(duì)照。取菌苔與含3%氯化鈉的5%甘油溶液制備濃厚的菌懸液，玻片凝集檢測K 抗原，3%氯化鈉溶液作為自凝對(duì)照。

1.3.4 毒力基因鑒定

用接種環(huán)刮取新鮮培養(yǎng)的菌苔于100 μL DNA裂解液中研磨均勻，100 ℃水浴10 min 后冰上放置5 min，12 000 r·min-1離心2 min，取上清液進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR 檢測毒力基因（tdh、trh、tlh）。

1.3.5 脈沖場凝膠電泳分型

分離出的5 株副溶血性弧菌以Not Ⅰ酶切，沙門菌標(biāo)準(zhǔn)菌株H9812 用限制性內(nèi)切酶Xba Ⅰ酶切，作為分子量標(biāo)（marker），電泳時(shí)間18 h，脈沖時(shí)間10 ～35 s，以Gelred 染膠后使用凝膠成像系統(tǒng)成像。

1.3.6 藥敏試驗(yàn)

按照微量肉湯稀釋法對(duì)分離的病原菌進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，采用定制的商品化MIC 藥敏板CHNENF 進(jìn)行藥敏測試，含氨芐西林、頭孢西丁、美羅培南、環(huán)丙沙星、氯霉素等17 種抗菌藥物，大腸埃希氏菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC 25922 作為本次試驗(yàn)的質(zhì)量控制菌株。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原體檢測

經(jīng)實(shí)時(shí)熒光PCR 檢測，所有樣品諾如病毒檢測均為陰性；食源性致病菌核酸多重實(shí)時(shí)熒光PCR 檢測出5 件病例肛拭樣品弧菌陽性，其余樣品均為陰性。28 件樣品進(jìn)行分離培養(yǎng)，熒光PCR 檢測為弧菌陽性的5 件樣品均分離到副溶血性弧菌，未檢出其他致病菌，其余8 件肛拭樣品和15 件留樣食品均未檢出致病菌。

2.2 血清學(xué)試驗(yàn)

分離到的5 株副溶血性弧菌均為O9:K44 血清型，結(jié)果一致。

2.3 毒力基因鑒定

對(duì)分離到的5 株副溶血性弧菌采用實(shí)時(shí)熒光PCR 方法檢測毒力基因，5 株副溶血性弧菌均為tdh、tlh 基因陽性，trh 基因陰性，結(jié)果一致。

2.4 PFGE 分子分型

用限制性內(nèi)切酶Not Ⅰ對(duì)5 株副溶血性弧菌基因組核酸酶切，進(jìn)行脈沖場凝膠電泳，結(jié)果如圖1 所示，YZFX2021-004、YZFX2021-005、YZFX2021-007 具有完全相同的帶型，另外2 株稍有不同。如圖2 所示，PFGE 分子分型聚類分析發(fā)現(xiàn)YZFX2021-004、YZFX2021-005、YZFX2021-007 的同源性為100%，YZFX2021-006 和YZFX2021-003 與 這3 株的同源性為88.89%、83.78%。

圖1 5 株副溶血性弧菌PFGE 圖像

圖2 5 株副溶血性弧菌PFGE 聚類分析圖譜

2.5 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

本次試驗(yàn)質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC 25922 藥敏結(jié)果在質(zhì)控范圍內(nèi)，表明試驗(yàn)結(jié)果有效。結(jié)果判定參照《疾控系統(tǒng)藥敏判斷標(biāo)準(zhǔn)-2022 修訂》，藥敏結(jié)果顯示5 株菌株對(duì)氨芐西林中度敏感，對(duì)氯霉素、甲氧芐啶/磺胺甲噁唑、多粘菌素 E、厄他培南、美羅培南、頭孢噻肟、頭孢他啶、頭孢他啶/阿維巴坦、四環(huán)素、替加環(huán)素、頭孢西丁、環(huán)丙沙星、萘啶酸、阿奇霉素、阿米卡星、鏈霉素均敏感，無多重耐藥表型，5 株菌株結(jié)果一致。

3 結(jié)論與討論

副溶血性弧菌引起的食物中毒事件在沿海地區(qū)時(shí)有發(fā)生，在微生物性食物中毒事件中高居首位，發(fā)生頻次、人群暴露規(guī)模均表現(xiàn)出明顯的上升趨勢。海產(chǎn)品是副溶血性弧菌食源性污染的主要媒介。隨著交通運(yùn)輸業(yè)的發(fā)展和內(nèi)陸居民飲食結(jié)構(gòu)的變化，我國微生物性食物中毒的致病因子逐步發(fā)生了變化。研究表明，在全國范圍內(nèi)，副溶血性弧菌導(dǎo)致的食物中毒事件數(shù)量已升至第二位，僅次于沙門氏菌[2]。實(shí)驗(yàn)室在5 名病例肛拭子中檢出血清型一致的副溶血性弧菌O9:K44 型，雖然未在留樣食物中檢出該菌，同時(shí)由于游輪方食品留樣不全，不排除游客食用了游船之外的食品，可能存在攜帶致病菌食物漏檢的情況。盡管未確定病因食品，但根據(jù)現(xiàn)場流行病學(xué)調(diào)查、患者的臨床表現(xiàn)、實(shí)驗(yàn)室檢測結(jié)果綜合分析，判定該事件為一起由副溶血性弧菌引起的聚集性、食源性疾病事件。

實(shí)驗(yàn)室通過熒光PCR 快速篩查和常規(guī)分離培養(yǎng)鑒定，迅速獲得了副溶血性弧菌核酸陽性結(jié)果，這一結(jié)論在后續(xù)的分離培養(yǎng)中得到證實(shí)，對(duì)于事件的及時(shí)處理和控制起到了關(guān)鍵作用。在突發(fā)性食源性疾病事件調(diào)查中，應(yīng)用快速檢測方法對(duì)于及時(shí)確定病原體、開展后續(xù)事件處置工作具有重要的意義。

副溶血性弧菌的致病性主要由毒力因子造成，毒力因子包括溶血素類、侵襲因子、尿素酶等。溶血素類包括耐熱直接溶血素（Thermostable Direct Hemolysin，TDH）和耐熱相關(guān)溶血素（Tdh-elated Hemolysin，TRH），二者作用于宿主細(xì)胞表面，可破壞細(xì)胞的完整性[3]。副溶血性弧菌還可產(chǎn)生不耐熱溶血素（Thermolabile Hemolysin，TLH），現(xiàn)普遍認(rèn)為tlh 基因是副溶血性弧菌的特異性基因，在所有分離株中均可檢測到。本實(shí)驗(yàn)室對(duì)分離培養(yǎng)出來的5株副溶血性弧菌進(jìn)行tdh、trh、tlh 基因檢測，發(fā)現(xiàn)5株菌株均為tdh 和tlh 基因陽性，trh 基因陰性。

PFGE 是目前廣泛應(yīng)用于食源性致病菌分子溯源的重要方法[4-5]。根據(jù)公認(rèn)的判定標(biāo)準(zhǔn)[6]，具有85%以上相同條帶的菌株可認(rèn)為是相同菌株。在本次事件中，分離到的5 株副溶血性弧菌有4 株菌株經(jīng)PFGE聚類分析發(fā)現(xiàn)具有85%以上的相似性，另一菌株帶型與這4 株稍有不同，提示本次事件中可能存在不同的污染源，但未從食品中分離出相關(guān)菌株，不能判斷本次事件的病因食品。

分離的5 株菌株對(duì)氨芐西林為中度敏感，對(duì)頭孢他啶、頭孢噻肟等其他16 種藥物均敏感，與重慶市萬州區(qū)報(bào)道[7]的藥敏結(jié)果相同，與廣州市、浙江省等地報(bào)道[8-12]的分離菌株對(duì)氨芐西林耐藥情況不同，與北京市、遼寧省等地[13-14]副溶血性弧菌的耐藥情況有顯著不同，表明耐藥性除了受血清型、來源背景的影響，還具有地域差異。水產(chǎn)品養(yǎng)殖應(yīng)規(guī)范、合理使用抗生素，避免副溶血性弧菌的耐藥性變異，降低多重耐藥的風(fēng)險(xiǎn)。對(duì)腹瀉病人進(jìn)行抗生素治療時(shí)，應(yīng)結(jié)合藥敏試驗(yàn)結(jié)果，確保臨床合理用藥，降低耐藥菌株的產(chǎn)生。

游輪旅游具有旅程時(shí)間較長、人員聚集程度較高等特點(diǎn)，相關(guān)部門應(yīng)加強(qiáng)對(duì)旅行機(jī)構(gòu)餐飲宴席等重點(diǎn)領(lǐng)域的日常監(jiān)管，強(qiáng)化食品安全知識(shí)的宣傳培訓(xùn)，提高食品相關(guān)從業(yè)人員的食品安全意識(shí)和個(gè)人衛(wèi)生意識(shí)，規(guī)范食品制作流程，注意生熟分開，并按要求做好食品的留樣，減少食源性疾病的發(fā)生。