不同取血方式對流式細胞術測定小鼠外周血單核細胞亞群比例的影響

李金龍

單核細胞是機體固有免疫系統的重要組成,作為首道防線維持機體內環境穩態。研究發現,單核細胞具有異質性。根據單核細胞表面標志物的差異,將人類單核細胞分為經典型、中間型、非經典型3 個亞群［1］,將小鼠單核細胞分為Ly6Chi和Ly6Clo兩個亞群［2］。近年來發現,單核細胞亞群比例失衡和功能失調是眾多炎癥相關疾病發生發展的重要病理生理學基礎之一［3］。2007 年,Nahrendorf 等［4］第一次發現小鼠單核細胞不同亞群的比例在小鼠急性心梗后出現動態變化：Ly6Chi單核細胞比例在小鼠急性心梗后迅速增加,在第 3 d 達到高峰,隨后開始下降；后續研究顯示,急性心梗后繼發的Ly6Chi單核細胞增多與心梗后心室重塑和心功能惡化有關。Zhou 等［5］發現小鼠心肌梗死后第3 d 外周血 Ly6Chi單核細胞增加至70%以上,使用多粘菌素可降低炎癥反應及Ly6Chi單核細胞比例。陳羽斐等［6］發現麝香保心丸通過減少循環中炎性單核細胞比例和斑塊中巨噬細胞含量,調控動脈粥樣硬化斑塊的炎癥反應。然而,不同研究中報道的Ly6Chi單核細胞亞群的比例不盡相同,對于標本的采集及處理也沒有統一的規范。本研究發現,不同取血方式下流式細胞術測定小鼠外周血單核細胞亞群比例差異明顯,采用下頜靜脈叢取血方式與國內外文獻多數報道最為接近。在涉及小鼠單核細胞亞群比例的研究中,應采取一致的采血方式。

1 材料與方法

1.1 一般材料 選擇18 只6 周齡雄性C57BL/6J 小鼠,購自解放軍軍事醫學科學院實驗動物中心。體重在14～17 g 之間,適應性喂養7 d 后進行隨機編號。喂養環境：室溫25℃左右,每天日光燈給光12 h,相對濕度55%～65%。抗CD11b-PE、抗Ly6G-PerCP/Cy5.5、抗Ly6C-FITC 購自美國Sigma 公司。本研究通過濱州醫學院附屬醫院實驗動物倫理委員會審(N02021-Z021-11)。根據編號將小鼠隨機分為乙醚麻醉+下頜靜脈叢取血組、下頜靜脈叢取血組、乙醚麻醉+摘眼球取血組,每組6 只。三組小鼠一般資料比較差異無統計學意義(P＞0.05),具有可比性。見表1。

表1 三組小鼠一般資料比較()

表1 三組小鼠一般資料比較()

注：三組比較,P＞0.05

1.2 方法

1.2.1 取血方法 三組小鼠通過相應取血方式采取外周血。乙醚麻醉+下頜靜脈叢取血組：用剪刀剪掉小鼠頜下毛發。乙醚麻醉后用5 ml 注射器針頭垂直刺入下頜靜脈,取血0.2 ml,滴入含有乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝劑的 EP 管內,輕輕顛倒,使全血與抗凝劑混勻。下頜靜脈叢取血組：取血前不進行乙醚麻醉,其余具體取血方法同乙醚麻醉+下頜靜脈叢取血組。乙醚麻醉+摘眼球取血組：乙醚麻醉后用消毒的鑷子摘取眼球后取血0.2 ml,滴入含有 EDTA 抗凝劑的 EP 管內,輕輕顛倒,使全血與抗凝劑混勻,后小鼠脫臼處死。

1.2.2 樣品制備 三組小鼠采取外周血后,在流式管中用同一微量移液器依次加入8.1 μl cell staining buffer、1.0 μl 抗Ly6G-PerCP/Cy5.5、0.7 μl 抗CD11b-PE、0.2 μl 抗Ly6C-FITC,然后加入30 μl 血液標本,混勻,置于22℃暗箱中孵育15 min,孵育結束后加入紅細胞裂解液600 μl(提前30 min 從冰箱中取出恢復室溫),混勻后22℃暗箱孵育10 min,孵育結束,渦旋器渦旋后上機檢測［7］。

1.2.3 上機檢測 流式細胞儀先用裝有超純水的流式管清洗2 次,打開預先設定的程序,依次檢測標本。側向散射光(side scatter,SSC)代表細胞的復雜性,以其為縱坐標,以Ly6G-PerCP/Cy5.5 熒光強度為橫坐標,不同種類的細胞將會以散點圖的形式出現在界面上。細胞被大致分為三群,Ly6G 主要表達于粒細胞表面,因此單核細胞存在于SSC 較低和Ly6G 熒光強度較弱的細胞群中,設門后將淋巴細胞和粒細胞去除。在下一步中,仍選擇SSC 為縱坐標,CD11b-PE 熒光強度為橫坐標,由于CD11b 主要在單個核細胞中表達,因此CD11b 表達較強的單核細胞可被分離出來。選擇Ly6C-FITC 熒光強度為縱坐標,SSC 為橫坐標,根據Ly6C 熒光強度強弱的不同,即可顯示出不同亞群單核細胞的比例。在本實驗中,將小鼠外周血單核細胞劃分為兩群,分別是Ly6Chi和Ly6Clo單核細胞。流式細胞術分離單核細胞亞群的過程見圖1 所示。應用FlowJo7.6.1 程序和CXP 程序分析每組數據,得到各組不同單核細胞亞群的比例［7］。

圖1 小鼠外周血單核細胞亞群設門方法

1.3 觀察指標 比較三組小鼠外周血Ly6Chi單核細胞亞群比例。

1.4 統計學方法 采用GraphPad8.3.0 統計學軟件對研究數據進行統計分析。計量資料以均數±標準差()表示,采用單因素測量方差(one-way ANOVA)分析,組內兩兩比較使用 Bonferroni 檢驗。P＜0.05 表示差異具有統計學意義。

2 結果

三組小鼠外周血Ly6Chi單核細胞亞群比例比較差異具有統計學意義(P＜0.01)。乙醚麻醉+摘眼球取血組小鼠外周血Ly6Chi單核細胞亞群比例(60.1±1.4)%明顯高于乙醚麻醉+下頜靜脈叢取血組的(51.1±2.1)%,差異有統計學意義(P＜0.01)。下頜靜脈叢取血組小鼠外周血Ly6Chi單核細胞亞群比例(57.1±1.5)%高于乙醚+下頜靜脈叢取血組的(51.1±2.1)%,但差異無統計學意義(P＞0.05)。乙醚麻醉+摘眼球取血組與下頜靜脈叢取血組小鼠外周血Ly6Chi單核細胞亞群比例比較差異無統計學意義(P＞0.05)。見圖2。

圖2 流式細胞術檢測各組Ly6Chi 單核細胞亞群

3 討論

單核細胞作為一種重要的免疫細胞,來源于骨髓,在血液中循環數天,分化為巨噬細胞和樹突狀細胞,參與病原微生物吞噬、抗原呈遞、T 細胞功能調節等重要過程,在無菌性及感染性炎癥疾病的生理病理進程中發揮重要作用［8,9］。單核細胞具有異質性,1989 年Ziegler-Heitbrock 利用單克隆抗體結合雙色流式細胞技術,第一次證實人外周血中存在CD14+CD16-和CD14+CD16+兩種單核細胞亞群。目前人類單核細胞分為經典型、中間型、非經典型3 個亞群［10］,小鼠單核細胞分為Ly6Chi和Ly6Clo兩個亞群［11］。近年來,人們對不同單核細胞亞群在疾病中的作用開展了許多研究。

目前對于單核細胞亞群的分類主要基于流式細胞術。本研究發現,在小鼠的單核細胞亞群研究中,不同的取血方式對相應結果的測定有影響,會導致結果的偏倚。應用乙醚麻醉小鼠后取下頜靜脈叢進行測定Ly6Chi單核細胞的比例在51%左右,應用乙醚麻醉小鼠后摘眼球取血測定值為60%左右,造成這種差別的原因可能與取血量以及應激有關。麻醉狀態以及下頜靜脈取血相對創傷較小,而應激狀態及特殊因素暴露均會引起單核細胞亞群表型的偏移。單核細胞在炎癥狀態下可以由骨髓遷移至外周,也可以分化為其他免疫細胞如巨噬細胞和樹突狀細胞,所以單核細胞長期處于動態平衡的狀態,對周邊環境的變化反應迅速。炎癥及多種趨化因子受體可控制單核細胞由骨髓遷移至外周,并分化為不同的單核細胞亞群。然而,目前尚不清楚不同單核細胞亞群之間的相互轉化的具體機制［12］。Nahrendorf 等［4］發現小鼠Ly6Chi單核細胞比例在小鼠急性心肌梗死后第3 天增加到高峰,隨后開始下降。高脂飲食會導致ApoE-/-小鼠Ly6Chi單核細胞明顯增加［13,14］。楊英杰等［15］發現,4 Gy γ 射線照射小鼠后第3 天外周血Ly6C+亞群比例顯著升高至90%。此外,李子安等［16］發現不同的樣本保存方式會影響流式細胞術檢測淋巴細胞亞群結果。欒正云等［17］發現單核細胞亞群檢測分析時易受標本放置時間的影響,標本采集后應盡快檢測,采集后4 g 內對檢測結果影響不大。這都提示不同環境以及處理方式會影響單核細胞亞群比例的測定。

Blood 發表的單核細胞亞群分型的國際共識中并沒有界定小鼠各分型的具體比例。Nahrendorf 等［4］發現小鼠Ly6Chi單核細胞比例在小鼠急性心肌梗死后第3 天從基線值55%左右達到75%,國內研究中,高脂飲食3 d 時C57BL/6J 小鼠Ly6Chi比例為40%［18］。楊英杰等［15］檢測到正常BALB/c 小鼠外周血Ly6C +亞群占總單核細胞比例約為55%,Ly6C +亞群的比例約為45%。張芯等［19］對C57BL/6J 腦梗小鼠模型以及向國安等［20］對小鼠矽肺模型的研究中,基線Ly6Chi亞群占總單核細胞比例約為55%和57%。對比本研究結果提示,在進行小鼠外周血單核細胞亞群的實驗研究中,下頜靜脈取血的結果與國內外文獻報道最為接近。然而,本研究未能應用流式分選技術將外周血 Ly6Chi單核細胞分離,進一步研究不同取血方式導致結果差異的確切機制。

綜上所述,不同取血方式對小鼠外周血單核細胞亞群比例測定有差異,在涉及小鼠單核細胞亞群比例的研究中,應采取一致的取血方式。