微流控紙芯片顯色法檢測圖像處理方法的比對*

鄭志鴻,夏敏珠,李一冰,張 劍

(西安醫學院 藥學院,陜西 西安 710021)

1990年Manz等首次報道提出微全分析系統(Micro totalanalysis system,μTAS),其最大限度地將分析實驗室的功能轉移至便攜設備或芯片中[1]。微流控紙芯片法(Microfluidic paper-based analytical devices,μPADs)由Whitesides研究小組于2007年首次提出[2],是全微分分析方法的重要分支。該方法用紙張代替了玻璃、硅、高聚物等基底材料,通過各種加工技術,在紙上加工出具有一定結構的親水或疏水微細通道網絡及相關分析器件,構成了“紙上微型實驗室”(lab-on-paper)[3]。目前,μPADs常用于定量分析,應用最廣的為比色法等[4],通常以RGB均值表征顯色強度并將其用于定量分析[5-8]。RGB值是一種工業色彩模式,其中R、G、B分別代表紅、綠、藍即光的三原色,每種顏色強度值為0～255。生活中的任何色彩都可以通過專業儀器或RGB識別類App直接掃描以獲取對應的一組RGB值[9]。

研究致力于以Gamma灰度值為橋梁構建μPADs定量分析新方法,從數據處理層面減小紙芯片定量分析誤差。Gamma灰度值是以純黑色為基準值,某一灰度與之相對的飽和度,理論為0～255。Gamma灰度值并不局限于表示黑白色組的深淺,任何顏色都可以通過其RGB值計算得到對應的Gamma灰度值,同一顏色深淺可以用Gamma灰度值大小量化[10]。因此,Gamma灰度值也可以用于量化紙芯片分析檢測中顯色物質顏色強度,目前未發現有相關文獻報道。

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

磷酸鹽緩沖溶液(PBS):pH=7.2～7.4,廣州和為醫藥科技有限公司;5,5′-二硫代雙(2-硝基苯甲酸)(DTNB或Ellman試劑):純度≥98%,半胱氨酸(Cys):純度≥99%,上海源葉生物科技有限公司。

電子天平:ES1035A,天津市德安特傳感技術有限公司;iPhone XS Max手機:A2104,1200萬像素,美國蘋果公司;1號定性濾紙:英國Whatman公司;噴蠟打印機:Xerox Phaser 8400,美國富士施樂集團有限公司;熱壓機:G311,福建阿普萊斯電器有限公司。

1.2 實驗原理

研究以人體危險因子Cys紙芯片分析檢測為例[11]。Cys與DTNB在紙芯片上反應,最終顯橙黃色,然后用手機對顯色的紙芯片拍照,再進一步通過數碼測色器App(Copyright ?2001-2020 Apple lnc.)分析得到對應的RGB值,對校正后的Gamma灰度值(Gray)計算見公式(1)。

(1)

式中:R、G、B分別代表紅、綠、藍的顏色強度。

現有的灰度值計算方法大都誤差較大,并不能滿足建立標準曲線的精度要求,因此實驗運用的灰度值經過Gamma校正計算,精度可滿足建立標準曲線,是目前最為準確的灰度值計算方法[12]。以RGB均值和Gamma灰度值分別建立標準曲線,用于檢測未知樣品濃度,并分析RGB均值法和灰度值法的優劣。

1.3 實驗步驟

1.3.1 紙芯片的制作

用Inkscape 0.91App設計紙芯片結構圖案,設計好的紙芯片用噴蠟打印機打印在定性濾紙上,然后于176.7 ℃下熱壓2 min,使濾紙表面粘附的蠟加熱熔化后滲入濾紙內部,取出后冷卻至室溫。紙芯片設計圖見圖1。

圖1 紙芯片設計圖

由圖1可知,黑色部分為打印的疏水區域,白色圓孔直徑為6 mm。濾紙為載體的紙芯片,主要起到分離、吸附和攔截作用[6],使反應只能在白色區域進行,保證顯色的均勻性和上樣量的一致性。

1.3.2 溶液配制

精密稱取0.060 51 g的Cys,用PBS(pH=7.2～7.4,20 mmol/L)溶解定容至50 mL容量瓶,得10 mmol/L Cys儲備液;用PBS稀釋Cys儲備液分別得0.3、0.4、0.5、0.6、0.7 mmol/L標準溶液;分別用PBS稀釋Cys儲備液至0.45、0.65 mmol/L得到樣品1和樣品2;精密稱取0.100 00 g DTNB溶解于約15 mL PBS中,加入ρ(NaOH)=0.001 g/mL溶液調節pH=6.81至全溶,再定容至25 mL,得ρ(DTNB)=4 mg/mL溶液。

1.3.3 紙芯片上顯色反應及數據處理

用移液器依次加載Cys與DTNB各3 μL至圖1紙芯片圓形反應區,兩者反應2.5 min后手機拍照記錄結果;用數碼測色計App識別并記錄其對應RGB值,每次在顯色區域中心附近隨機取5個點的RGB值。然后分別測量計算樣品1和2的RGB均值和Gamma灰度值,利用對應標準曲線測得樣品1和2的濃度。樣品1和2各測量5次,分別取平均值作為最終測量濃度,并計算其絕對誤差、相對誤差和相對標準偏差(RSD)。

2 結果與討論

2.1 標準曲線

RGB值和Gamma灰度值的標準曲線見圖2。

c/(mmol·L-1)

由圖2可知,RGB均值法標準曲線方程為y=82.333x+27.06,R2=0.998 6,線性范圍為0.3～1 mmol/L;Gamma灰度值法標準曲線方程為y=77.976x+22.402,R2=0.999 4,線性范圍為0.2～1 mmol/L。運用Gamma灰度值法量化紙芯片的顯色強度,線性關系優于RGB均值法,R2增大了0.08%,線性范圍增加了14.29%。另外Gamma灰度值法從數據處理層面減小了微流控紙芯片定量分析的實驗誤差。兩者均具有上樣量小,靈敏度高的特點,且使用過程中無需大型儀器[13-15]。

2.2 誤差與分析

樣品1和2的實際濃度分別為0.45、0.65 mmol/L,測定誤差與偏差見表1。

表1 2種方法的誤差與精密度數據1)

由表1可知,其中樣品1為低濃度樣品,Gamma灰度值法和RGB均值法RSD均偏大,是由于溶劑打濕紙芯片后使背景值增加過大,且手機攝像頭采集精度有限,因此低濃度樣品顯色較淺時,精密度會有所下降。

3 結 論

RGB均值法數據處理簡單,誤差較Gamma灰度值法稍大。Gamma灰度值法較為復雜,但線性關系更好,在實際應用中均能滿足要求,可根據具體情況進行選擇。2種方法均基于紙芯片的定量分析,具有上樣量小、靈敏度高、操作簡單、便攜度高等諸多優勢。使用過程中無需大型儀器,對實際樣品的檢測速度快,具有較好的應用前景。