一起云南不明原因猝死案件中4 種野生菌的細(xì)胞毒性

龍武，瞿鵬飛，馬琳，王蕊，習(xí)嚴(yán)梅，李玉華，聶勝潔，段婷，杜進(jìn)良，唐雪，趙靜峰，雷普平，王躍兵

1.昆明醫(yī)科大學(xué)法醫(yī)學(xué)院，云南 昆明 650500；2.北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)系，北京 100191；3.云南省地方病防治所，云南 大理 671000；4.云南大學(xué)化學(xué)科學(xué)與工程學(xué)院 教育部自然資源藥物化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 云南省天然產(chǎn)物轉(zhuǎn)化與應(yīng)用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650500

云南不明原因猝死（Yunnan sudden unexplained death，YNSUD）是一類特殊的不明原因猝死（sudden unexplained death，SUD），主要發(fā)生于云南中、西部山區(qū)或半山區(qū)，時(shí)間集中于每年的6～9 月，即使通過(guò)尸體解剖、組織病理學(xué)檢驗(yàn)及其他各種輔助檢查，仍然不能明確死因[1-2]。流行病學(xué)研究[3]還發(fā)現(xiàn)，YNSUD 在同一家庭或同一家族中發(fā)生率較高，表現(xiàn)出家庭或家族聚集性的特點(diǎn)。YNSUD 的病因和死亡機(jī)制迄今尚未闡明，雖然多位學(xué)者先后提出過(guò)腸道病毒感染、低硒、飲用水污染、遺傳疾病等假說(shuō)[4]，但都還不能被廣泛接受。此前有報(bào)道提出毒溝褶菌（Trogia venenata，又稱“小白菌”）中毒學(xué)說(shuō)[5]，得到較為廣泛的認(rèn)同，然而，之后的調(diào)查發(fā)現(xiàn)，部分YNSUD 病區(qū)并無(wú)毒溝褶菌分布[6-8]，針對(duì)毒溝褶菌的預(yù)防措施也未能完全阻止YNSUD 的再次發(fā)生，故毒溝褶菌中毒學(xué)說(shuō)亦不足以解釋YNSUD 的死亡原因。

某年7 月，云南省某地發(fā)生了一起家庭聚集性死亡案件，一個(gè)五口之家中的3 名女性（相互間均具有血緣關(guān)系）在48 h 內(nèi)先后死亡，過(guò)程急驟，且3 名死者均在發(fā)病后1 h內(nèi)死亡[9]。該事件由多領(lǐng)域?qū)＜視?huì)診后一致認(rèn)定為典型YNSUD 事件[10]。經(jīng)對(duì)死者進(jìn)行尸體解剖和對(duì)幸存者進(jìn)行生化指標(biāo)檢測(cè)，均未能解釋死因。經(jīng)全基因組重測(cè)序，雖然發(fā)現(xiàn)死者存在3-羥酰基輔酶A 脫氫酶（3-hydroxyacyl-CoA dehydrogenase，HADH；rs74428123，c.99C＞G，p.I33M）、蛋白激酶A 錨定蛋白9（A kinase anchoring protein 9，AKAP9；rs146797353，c.1204G＞A，p.A1276G）等可能致病的基因變異，但是單獨(dú)從基因突變的角度難以解釋該事件發(fā)生的時(shí)間、空間聚集性[10]。經(jīng)深入調(diào)查，發(fā)現(xiàn)該家庭曾食用過(guò)當(dāng)?shù)匾吧Ｒ虼耍狙芯繑M對(duì)該案中涉及的野生菌毒性進(jìn)行探討，以期發(fā)現(xiàn)YNSUD 的死因，為防治YNSUD提供幫助。

1 材料與方法

1.1 樣本

在猝死發(fā)生地采集該家庭成員事發(fā)前曾食用的4 種野生菌，每種1 kg。4 種野生菌在當(dāng)?shù)氐拿Q分別是“酸菌”“青頭菌”“麻母雞菌”“黃見(jiàn)手青”。

1.2 主要儀器和試劑

ZKF030 電熱真空干燥箱（紹興市銀河機(jī)械儀器有限公司），S203 電子分析天平（意大利BEL Engineering 公司），5415D 高速離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf 公司），XZ-1 抽濾系統(tǒng)（上海靳瀾儀器制造有限公司），Hei-VAP Advantage 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā) 儀（德國(guó)Heidolph 公司），JC-SHP-30 隔水式恒溫培養(yǎng)箱（青島聚創(chuàng)環(huán)保集團(tuán)有限公司），ELx800 全自動(dòng)酶標(biāo)儀（美國(guó)BioTek 公司），HH-2 恒溫水浴鍋（杭州恒儀儀表科技有限公司），CKX41 倒置相差顯微鏡（日本Olympus 公司）。

HEK293 細(xì)胞（湖南豐暉生物科技有限公司），DMEM 高糖培養(yǎng)基、胎牛血清、雙抗、Opti-MEM 減血清培養(yǎng)基（美國(guó)Thermo Fisher Scientific 公司），風(fēng)味蛋白酶（北京索萊寶科技有限公司）。細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒-8（Cell Counting Kit-8，CCK-8）和乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）檢測(cè)試劑盒（Cytotoxicity LDH Assay Kit-WST）均購(gòu)自東仁化學(xué)科技（上海）有限公司。

1.3 野生菌種屬鑒定

本研究采集的4 種野生菌，首先由中國(guó)科學(xué)院昆明植物研究所進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定。然后，每種野生菌隨機(jī)挑選3 株子實(shí)體，切取菌柄和菌蓋連接部分0.1 g，使用離心柱法提取基因組DNA，采用真菌核糖體rDNA內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（internal transcribed spacer，ITS）序列通用引物ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）和ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）擴(kuò)增rDNA部分序列，然后對(duì)其進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序結(jié)果上傳至BLAST網(wǎng)站（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）中檢索其與數(shù)據(jù)庫(kù)中其他真菌核酸序列的相似度，序列相似度最高的真菌即為鑒定結(jié)果[11-13]。

1.4 野生菌3 種浸膏的制備

挑選新鮮的野生菌，剔凈泥土雜質(zhì)，稱重，定量1 kg，切成2 mm 厚的薄片，攤開(kāi)置于宣紙上，放入電熱真空干燥箱37 ℃烘干過(guò)夜，制成干品。用電動(dòng)打粉機(jī)將干品打成粉末，過(guò)50 目篩，制成干粉[14]。

第1 種：稱取5 g 野生菌干粉置于100 mL 圓底燒瓶中，加入60 mL 50%乙醇溶液，超聲波處理器萃取30 min，反復(fù)萃取3 次，抽濾提取液。將提取液置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中，溫度維持在60 ℃，溶劑蒸發(fā)完全后制得野生菌生品浸膏。

第2 種：稱取5 g 野生菌干粉置于100 mL 燒杯中，加入100 mL 蒸餾水，電煮鍋加熱煮沸10 min，濃縮至60 mL，加入60 mL 無(wú)水乙醇。超聲波處理器萃取30 min，反復(fù)萃取3 次，抽濾提取液。將提取液置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中，溫度維持在60 ℃，溶劑蒸發(fā)完全后制得野生菌熬煮浸膏。

第3 種：稱取5 g 野生菌干粉置于100 mL 燒杯中，加入100 mL 蒸餾水，電煮鍋加熱煮沸10 min，補(bǔ)足蒸餾水至100 mL，然后加入1 g 風(fēng)味蛋白酶，將混合物攪拌均勻后分裝至3 支50 mL 的離心管中，置于56 ℃恒溫水浴鍋過(guò)夜（約16 h），其間多次振蕩，后轉(zhuǎn)移至100 mL 燒杯中，加入1 mL 40%濃鹽酸溶液混勻，56 ℃水浴加熱攪拌30 min，揮發(fā)多余鹽酸，微波爐加熱煮沸10 min，滅活蛋白酶，濃縮至60 mL，加入60 mL 無(wú)水乙醇。超聲波處理器萃取30 min，反復(fù)萃取3 次，抽濾提取液。將提取液置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中，溫度維持在60 ℃，溶劑蒸發(fā)完全后制得野生菌熬煮后酶解浸膏[15]。

1.5 細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)

復(fù)蘇HEK293 細(xì)胞，用DMEM 高糖培養(yǎng)基、胎牛血清、雙抗按90∶10∶1 的體積比配制成的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)環(huán)境溫度為37 ℃，CO2濃度為5%。待鋪板面積達(dá)90%后接種至96 孔板，每孔100 μL，接種密度約為1×105/mL。恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)至細(xì)胞鋪滿96 孔板后，更換減血清培養(yǎng)基（1%胎牛血清）饑餓處理8 h 后再進(jìn)行后續(xù)操作。

對(duì)4 種野生菌的生品浸膏分別設(shè)置0.001、0.005、0.01、0.05、0.1、0.5、1.0 mg/mL質(zhì)量濃度梯度干預(yù)HEK293 細(xì)胞，同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照組，每個(gè)質(zhì)量濃度設(shè)3 個(gè)復(fù)孔，干預(yù)24 h 后，進(jìn)行CCK-8 檢測(cè)，篩選出有細(xì)胞毒性的野生菌以及適合的濃度區(qū)間。篩選出的有細(xì)胞毒性的野生菌增加熬煮和熬煮后酶解的浸膏制備方式，進(jìn)一步檢驗(yàn)常規(guī)烹制和烹制后消化是否可以減毒。

將篩選出的野生菌制備成生品浸膏、熬煮浸膏、熬煮后酶解浸膏，溶解后稀釋為0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0 mg/mL質(zhì)量濃度梯度干預(yù)HEK293細(xì)胞，同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照組，每個(gè)質(zhì)量濃度設(shè)3 個(gè)復(fù)孔。干預(yù)24 h 后，取細(xì)胞培養(yǎng)液100 μL 至新的96 孔板，用于LDH 檢測(cè)，向96 孔板中再次加入減血清培養(yǎng)基100 μL，用于CCK-8 檢測(cè)。

CCK-8 細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)與LDH 檢測(cè)均屬于測(cè)定細(xì)胞毒性的高靈敏度比色檢測(cè)法。CCK-8 試劑可與活細(xì)胞內(nèi)的脫氫酶生成水溶性有色甲臜，通過(guò)檢測(cè)甲臜染料在450 nm 處的吸光度可以檢測(cè)活細(xì)胞數(shù)量，細(xì)胞增殖越多、越快，則顏色越深，反之，則顏色越淺。LDH 檢測(cè)試劑盒中的無(wú)色水溶性四唑鹽（watersoluble tetrazolium，WST）可與受損細(xì)胞所釋放出的LDH反應(yīng)生成橙黃色甲臜，通過(guò)檢測(cè)甲臜染料在490 nm處的吸光度可以測(cè)定死細(xì)胞和受損細(xì)胞的數(shù)量，甲臜產(chǎn)物的吸光度值與LDH 的量成正比。CCK-8 細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)與LDH 檢測(cè)法所產(chǎn)生的有色物質(zhì)的顏色深淺由酶標(biāo)儀檢測(cè)，以吸光度的形式表示。結(jié)合CCK-8細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)與LDH 檢測(cè)法可以同時(shí)測(cè)定浸膏干預(yù)后活細(xì)胞和死細(xì)胞的數(shù)量，更全面地表征細(xì)胞毒性。將不同質(zhì)量濃度（0.1、0.5、1.0、5.0 mg/mL）的有毒野生菌浸膏干預(yù)后的細(xì)胞放于倒置相差顯微鏡下觀察，對(duì)細(xì)胞形態(tài)、數(shù)量和特征性變化進(jìn)行描述并拍照。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果

2.1 4 種野生菌的種屬鑒定結(jié)果

采集的4 種野生菌（圖1）經(jīng)中國(guó)科學(xué)院昆明植物研究所鑒定，“酸菌”為美味牛肝菌（Boletus edulis），“青頭菌”為變綠紅菇（Russula virescens），“麻母雞菌”為隱花青鵝膏（Amanita manginiana），“黃見(jiàn)手青”為粉黃黃肉牛肝菌（Butyriboletus roseoflavus）。

圖1 本案涉及的4 種野生菌Fig.1 The 4 wild mushrooms involved in the case

野生菌測(cè)序結(jié)果顯示：“青頭菌”“麻母雞菌”和“黃見(jiàn)手青”樣本與參考序列的相似度均大于99%，可直接鑒定種屬，“青頭菌”樣本為變綠紅菇，“麻母雞菌”樣本為隱花青鵝膏，“黃見(jiàn)手青”樣本為粉黃黃肉牛肝菌[16-17]；“酸菌”樣本與參考序列的相似度不足99%，但考慮到“酸菌”樣本與美味牛肝菌的基因相似度最高，仍可達(dá)96.65%，尚可認(rèn)為是美味牛肝菌。

2.2 4 種野生菌生品浸膏的細(xì)胞毒性檢測(cè)結(jié)果

采用CCK-8 檢測(cè)4 種野生菌生品浸膏對(duì)HEK293細(xì)胞的毒性實(shí)驗(yàn)初步篩選出可能有毒的野生菌為隱花青鵝膏。在質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL 時(shí)，隱花青鵝膏生品浸膏干預(yù)孔的吸光度值較空白對(duì)照孔降低，即產(chǎn)生細(xì)胞毒性，隨著質(zhì)量濃度的增加，細(xì)胞毒性逐漸增強(qiáng)。其他3 種野生菌生品浸膏干預(yù)孔的吸光度值未見(jiàn)明顯變化，詳見(jiàn)表1。

表1 CCK-8 法檢測(cè)4 種野生菌生品浸膏對(duì)HEK293 細(xì)胞的毒性Tab.1 Cytotoxicity of raw extracts of 4 wild mushrooms to HEK293 cells detected by CCK-8 ［n=3，，L/（g·cm）］

表1 CCK-8 法檢測(cè)4 種野生菌生品浸膏對(duì)HEK293 細(xì)胞的毒性Tab.1 Cytotoxicity of raw extracts of 4 wild mushrooms to HEK293 cells detected by CCK-8 ［n=3，，L/（g·cm）］

注：1）0 為空白對(duì)照組的質(zhì)量濃度；2）與空白對(duì)照組比較，P＜0.05。

2.3 隱花青鵝膏3 種浸膏的細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

CCK-8 細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：隱花青鵝膏生品浸膏在質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL 時(shí)對(duì)HEK293 細(xì)胞有毒性，熬煮浸膏在質(zhì)量濃度為0.4 mg/mL 時(shí)對(duì)HEK293 細(xì)胞有毒性，熬煮后酶解浸膏在質(zhì)量濃度為0.7 mg/mL時(shí)對(duì)HEK293 細(xì)胞有毒性，詳見(jiàn)表2。

表2 CCK-8 法檢測(cè)隱花青鵝膏3 種浸膏對(duì)HEK293 細(xì)胞的毒性Tab.2 Cytotoxicity of 3 kinds of Amanita manginiana extracts to HEK293 cells detected by CCK-8 ［n=3，，L/（g·cm）］

表2 CCK-8 法檢測(cè)隱花青鵝膏3 種浸膏對(duì)HEK293 細(xì)胞的毒性Tab.2 Cytotoxicity of 3 kinds of Amanita manginiana extracts to HEK293 cells detected by CCK-8 ［n=3，，L/（g·cm）］

注：1）0 為空白對(duì)照組的質(zhì)量濃度；2）與空白對(duì)照組比較，P＜0.05。

LDH 檢測(cè)法檢測(cè)細(xì)胞毒性結(jié)果顯示：隱花青鵝膏生品浸膏在質(zhì)量濃度為0.2 mg/mL 時(shí)對(duì)HEK293 細(xì)胞有毒性，熬煮浸膏在質(zhì)量濃度為0.6 mg/mL 時(shí)對(duì)HEK293 細(xì)胞有毒性，熬煮后酶解浸膏在質(zhì)量濃度為0.7 mg/mL 時(shí)對(duì)HEK293 細(xì)胞有毒性，詳見(jiàn)表3。

表3 LDH 檢測(cè)法檢測(cè)隱花青鵝膏3 種浸膏對(duì)HEK293 細(xì)胞的毒性Tab.3 Cytotoxicity of 3 kinds of Amanita manginiana extracts to HEK293 cells detected by LDH Assay Kit ［n=3，，L/（g·cm）］

表3 LDH 檢測(cè)法檢測(cè)隱花青鵝膏3 種浸膏對(duì)HEK293 細(xì)胞的毒性Tab.3 Cytotoxicity of 3 kinds of Amanita manginiana extracts to HEK293 cells detected by LDH Assay Kit ［n=3，，L/（g·cm）］

注：1）0 為空白對(duì)照組的質(zhì)量濃度；2）與空白對(duì)照組比較，P＜0.05。

2.4 隱花青鵝膏3 種浸膏干預(yù)后HEK293 細(xì)胞的形態(tài)變化

將不同質(zhì)量濃度的隱花青鵝膏3種浸膏對(duì)HEK293細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)，觀察HEK293 細(xì)胞的形態(tài)變化，結(jié)果顯示：質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL 時(shí)，僅發(fā)現(xiàn)生品浸膏組細(xì)胞數(shù)量稍有降低。質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL時(shí)，生品浸膏組和熬煮浸膏組細(xì)胞體積稍增大，突觸略有增多，細(xì)胞數(shù)量稍有降低；熬煮后酶解組細(xì)胞未見(jiàn)明顯變化。質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL 時(shí)，生品浸膏組和熬煮浸膏組細(xì)胞數(shù)量均明顯減少，生品浸膏組細(xì)胞突觸增多，折光性較差，熬煮后酶解組細(xì)胞數(shù)量也略有減少，但形態(tài)未發(fā)生明顯變化。質(zhì)量濃度為5.0 mg/mL時(shí)，生品浸膏組細(xì)胞幾乎全部死亡，鏡下可見(jiàn)細(xì)胞大片溶解、死亡，呈透明小球或碎片狀漂浮于培養(yǎng)基中；熬煮浸膏組細(xì)胞數(shù)量減少了約70%，存活細(xì)胞折光性差，邊界不清晰，突觸增加且有延長(zhǎng)；熬煮后酶解組細(xì)胞數(shù)量明顯減少，細(xì)胞也有突觸增多的現(xiàn)象。詳見(jiàn)圖2。

圖2 隱花青鵝膏3 種浸膏干預(yù)后HEK293 細(xì)胞的形態(tài)學(xué)改變（×100）Fig.2 Morphological changes of HEK293 cells after intervention with 3 kinds of Amanita manginiana extracts（×100）

3 討論

云南不明原因猝死（曾用名“云南暴發(fā)性病毒性心肌炎”“云南不明原因心源性猝死”“云南地方性猝死”）是一種發(fā)生于云南一些偏遠(yuǎn)山區(qū)和半山區(qū)的具有時(shí)間、空間聚集性的特殊不明原因猝死。陸步來(lái)等[2]的研究發(fā)現(xiàn)，1975 年在云南省華寧縣首次報(bào)道了3 例猝死病例后，在云南各地相繼出現(xiàn)此類猝死病例，先后有23 個(gè)縣（區(qū)）報(bào)告了375 例此類猝死病例。YNSUD嚴(yán)重影響了病區(qū)的社會(huì)安定和正常生產(chǎn)、生活秩序，是云南省目前較為嚴(yán)重的地方性公共衛(wèi)生問(wèn)題。

云南盛產(chǎn)野生菌，在各地區(qū)均廣泛采食，每年6～9 月野生菌大量出土，與此同時(shí)，野生菌中毒案件頻發(fā)。食用野生菌和YNSUD 案件發(fā)生在時(shí)間、空間上存在一定的吻合，提示野生菌中毒和YNSUD 之間可能存在某種聯(lián)系。本起案件中，五口之家中的3 名女性在48 h 內(nèi)先后死亡，死亡過(guò)程急驟，主要癥狀為突然的意識(shí)喪失伴抽搐，3 名受害者均在發(fā)病后1 h 內(nèi)死亡，通過(guò)對(duì)其中2 名死者進(jìn)行系統(tǒng)尸體檢驗(yàn)、常規(guī)毒（藥）物檢驗(yàn)和組織病理學(xué)檢驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)兩人僅偶見(jiàn)小灶性心肌變性及炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，不能以此認(rèn)定死因，常規(guī)毒（藥）物檢驗(yàn)結(jié)果均為陰性。雖然家庭中另外2名男性幸存者的血清生化指標(biāo)顯示部分心肌酶和肝酶非特異性輕度升高，但是2 d 后即恢復(fù)正常，因此認(rèn)為系應(yīng)激所致[9]。僅從自身疾病或基因突變的角度，難以解釋該事件中3 人先后于48 h 內(nèi)發(fā)生死亡的時(shí)間和空間聚集性，這提示可能存在共同的暴露因素。

通過(guò)回顧調(diào)查死者家庭食譜，發(fā)現(xiàn)該家庭于事發(fā)前進(jìn)食過(guò)當(dāng)?shù)卣J(rèn)為無(wú)毒的野生菌。同一種野生菌可能由于地域差異，其基因組也會(huì)有部分差異；季節(jié)、生長(zhǎng)環(huán)境差異以及處于不同生長(zhǎng)期的子實(shí)體也可能導(dǎo)致其子實(shí)體內(nèi)的化合物及微量元素有明顯差異，其毒性也可能不同[18-19]。所以，本研究對(duì)該事件中涉及的野生菌進(jìn)行了毒性研究。因?yàn)楦文I損害是蘑菇中毒致死的主要機(jī)制，同時(shí)考慮到人胚腎細(xì)胞（HEK293細(xì)胞）是毒性實(shí)驗(yàn)常用細(xì)胞，故本研究選用其進(jìn)行細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)[20-21]。

該起案件中食用的4 種野生菌樣本均采自事發(fā)當(dāng)?shù)兀ㄟ^(guò)形態(tài)學(xué)特征及基因測(cè)序鑒定種屬。4 種野生菌均屬于真菌門（Eumycota）、擔(dān)子菌亞門（Basidiomycotina）、擔(dān)子菌綱（Basidiomycetes）、傘菌目（Agaricales），其中粉黃黃肉牛肝菌、美味牛肝菌屬于牛肝菌科、牛肝菌屬，變綠紅菇屬于紅菇科、紅菇屬，隱花青鵝膏屬于鵝膏菌科、鵝膏菌屬。本次事件中食用的粉黃黃肉牛肝菌曾被報(bào)道為低毒性，中毒癥狀包括典型的精神癥狀、幻視以及胃腸道癥狀，但尚未見(jiàn)中毒致死的案件報(bào)道，并且其充分加熱烹制可以完全滅毒[22-23]。本研究中，在1.0 mg/mL 的生品浸膏干預(yù)下，粉黃黃肉牛肝菌并未顯示出明顯細(xì)胞毒性，說(shuō)明其生品浸膏在此劑量下不具有細(xì)胞損傷毒性，因此認(rèn)為該起案件與食用粉黃黃肉牛肝菌無(wú)關(guān)。針對(duì)美味牛肝菌和變綠紅菇的研究較多，但尚未發(fā)現(xiàn)其具有明顯毒性，本實(shí)驗(yàn)也支持這一觀點(diǎn)。隱花青鵝膏雖然屬于鵝膏屬，但不同于大眾所熟知的劇毒鵝膏，目前該菌被學(xué)界定義為可食用野生菌，相關(guān)的研究相對(duì)較少。陳作紅等[21，24]對(duì)我國(guó)28 種鵝膏菌進(jìn)行6 種常見(jiàn)鵝膏肽類毒素檢測(cè)，未在隱花青鵝膏中檢出鵝膏肽類毒素，但本實(shí)驗(yàn)中，在1.0 mg/mL 的生品浸膏干預(yù)下，隱花青鵝膏顯示出明顯細(xì)胞毒性，這提示隱花青鵝膏可能存在常見(jiàn)鵝膏毒肽以外的其他毒素。

本研究還對(duì)隱花青鵝膏增加了熬煮、熬煮后酶解兩種浸膏制作方法，分別模擬當(dāng)?shù)鼐用駥?duì)野生菌的常見(jiàn)烹制方式和烹制后進(jìn)食消化過(guò)程，發(fā)現(xiàn)隱花青鵝膏的3 種浸膏對(duì)HEK293 細(xì)胞均有明顯毒性，并呈劑量依賴。CCK-8 法檢測(cè)出的隱花青鵝膏中毒量為生品浸膏≥0.1 mg/mL、熬煮浸膏≥0.4 mg/mL、熬煮后酶解浸膏≥0.7 mg/mL，LDH 檢測(cè)法篩選出的隱花青鵝膏中毒量為生品浸膏≥0.2 mg/mL、熬煮浸膏≥0.6 mg/mL、熬煮后酶解浸膏≥0.7 mg/mL。兩種方法均能有效驗(yàn)證3 種浸膏對(duì)HEK293 細(xì)胞的毒性，結(jié)果上的少許偏差可能是3 種浸膏溶液自身的顏色影響了細(xì)胞培養(yǎng)液的吸光度值。本研究中雖然熬煮浸膏的中毒劑量較生品浸膏增加，但當(dāng)熬煮浸膏質(zhì)量濃度≥0.6 mg/mL 時(shí)，其細(xì)胞毒性與生品浸膏相近，所以熬煮并不能完全減毒；熬煮后酶解浸膏質(zhì)量濃度≥0.7 mg/mL 時(shí)也顯現(xiàn)出細(xì)胞毒性，同樣不能完全減毒。野生菌的活性成分極其豐富，主要包括多糖、生物堿、萜類化合物、蛋白質(zhì)以及維生素、有機(jī)酸等物質(zhì)[25]。本研究中，隱花青鵝膏的活性成分采用有機(jī)溶劑提取，且在高溫和酶解處理后活性降低，初步判斷此活性物質(zhì)可能是蛋白質(zhì)類或萜類化合物，具體物質(zhì)有待分離、純化和結(jié)構(gòu)分析確定。

綜上，本研究通過(guò)對(duì)一起典型YNSUD 案件的環(huán)境暴露因素進(jìn)行分析，揭示了隱花青鵝膏提取物具有明顯的細(xì)胞毒性，且加熱、酶解處理無(wú)法完全滅毒，故食用該菌存在一定的安全隱患。隱花青鵝膏的分布與YNSUD 疫區(qū)存在多大程度的重疊以及隱花青鵝膏是否存在心肌毒性等問(wèn)題還有待后續(xù)調(diào)查和實(shí)驗(yàn)研究解決。